miR-449a对上皮后囊混浊晶状体上皮细胞增殖、迁移及间质转化的影响及机制

徐晓玮，田爱军，陈红，郝微

(河北省眼科医院，河北邢台054001)

后囊浑浊是白内障术后最常见的并发症，可导致患者出现继发性视力丧失[1]。研究显示，后囊混浊的发生与术后残留的晶状体上皮细胞增殖、迁移及上皮间质转化(EMT)等过程有关[2]。miRNA在许多疾病发生及多种细胞生理状态变化中发挥重要作用，包括晶状体上皮细胞凋亡、迁移、增殖和EMT[3]。研究结果显示，miR-26b高表达抑制晶状体上皮细胞迁移和EMT，减少白内障术后后囊混浊发生[4]。并且miRNA靶向酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)调节非小细胞肺癌细胞的凋亡[4]，影响上皮性卵巢癌细胞的增殖和迁移[5]。miRNA通过调节c-Myc基因的表达影响膀胱癌细胞EMT。miR-449a可靶向抑制c-Myc的表达从而增强前列腺癌细胞的放疗耐受性[6]。miR-449a通过抑制EMT抑制胃癌细胞的侵袭[7]。但miR-449a在晶状体上皮细胞中的作用尚未见报道。2017年11月～2018年6月，本研究对miR-449a在晶状体上皮细胞增殖、迁移及EMT中的作用进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 后囊混浊组织晶状体上皮细胞(PCO-LECs)及正常附着组织晶状体上皮细胞(normal-LECs)由中国北京眼库提供；人胚肾细胞(HEK-293T)购自北京北纳生物科技有限公司；胎牛血清及DMEM培养基购自美国Gibco公司；TRIzol、LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自中国大连Takara公司；Pierce BCA Protein Assay Kit购自美国Pierce公司；MTT试剂盒及RIPA缓冲液购自上海碧云天公司；PVDF膜购自美国Life Technologies公司；双荧光素酶检测试剂盒购自广州赛哲生物科技股份有限公司；miR-449a mimics、scrambled序列、3′UTR突变型c-Met/c-Myc和野生型c-Met/c-Myc购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 细胞培养 将晶状体囊分散于培养皿上，使内皮细胞向上。将胎牛血清滴到内皮细胞表面，使晶状体上皮细胞充分附着于培养皿表面。加入含有20%胎牛血清的DMEM培养基，将细胞于5% CO2、37 ℃条件下培养用于后续实验。HEK-293T细胞培养于DMEM培养基中，并添加10%胎牛血清，培养条件为5% CO2、37 ℃。

1.3 晶状体上皮细胞转染 当PCO-LECs细胞满度为80%～90%时，按照3×105/mL将细胞接种于6孔板中。按照操作说明采用LipofectamineTM2000向细胞中转染miR-449a特异性的mimics(mimics组)以及scrambled序列作为对照组(miR-NC组)。

1.4 晶状体上皮细胞miR-449a及上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、纤黏蛋白(fibronectin)表达检测 采用qRT-PCR法检测细胞miR-449a表达，按照生产厂家的使用说明书收集组织或转染后的细胞，以TRIzol试剂盒提取细胞或组织中的总RNA，并使用反转录试剂盒将RNA反转录生成cDNA，分析晶状体上皮细胞miR-449a表达。miR-449a上游引物序列：5′-TGGCGGTGGCAGTGTATTGTTA-3′；下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；采用GAPDH作为内参，其上游引物序列：5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物序列：5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。反应体系： 2×SYBR®Green Realtime PCR Master Mix 7.5 mL，引物混合物0.6 mL， cDNA模板1 mL，ddH2O 5.9 mL。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s循环40次，95 ℃处理1 min，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。采用酶联免疫吸附法测定细胞内E-cadherin、fibronectin蛋白表达。将稀释后的样品50 μL加入反应孔，立即加入生物素标记的抗体50 μL，盖上膜板，室温震荡孵育45 min，洗涤，振荡30 s，重复操作3次，加入标记的HRP 100 μL，再次孵育30 min，洗涤，振荡30 s，重复操作3次。然后加入显色底物，在酶标仪下读取各孔吸光度值。

1.5 晶状体上皮细胞增殖活力检测 采用MTT法。转染24 h，收集细胞，并采用含有10%胎牛血清的培养基将细胞配成单细胞悬浮液，以1×104/孔接种于96孔板，每孔体积为200 μL。在37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养至细胞单层铺满孔底，加入CPT-11，在相同条件下孵育24 h，每孔加入0.5%的MTT溶液10 μL。孵育4 h后，每孔加入DMSO 100 μL，振荡10 min使结晶物完全溶解，采用酶联免疫检测仪测量490 nm处各孔吸光度值。

1.6 晶状体上皮细胞迁移能力检测 采用Transwell法。将1×105个细胞接种在含无血清DMEM培养基的上室中，之后向下室中加入含20%胎牛血清DMEM培养基600 μL，培养48 h后，采用棉絮擦拭以去除上室中非侵袭性细胞。用4%多聚甲醛处理膜的下表面，固定迁移细胞，并用0.1%结晶紫溶液在室温条件下进行染色。随机取5个视野对迁移细胞进行计数。

1.7 miR-449a对c-Myc、c-Met表达的靶向抑制作用检测 采用双荧光素酶实验。将c-Met或c-Myc mRNA的3′-UTR区克隆至 psicheck-2载体，构建psicheck-c-Met-wt及psicheck-c-Myct-wt报告基因质粒；将c-Met或c-Myc mRNA的3′-UTR区突变后克隆至psicheck-2 载体，构建 psicheck-c-Met-mut及psicheck-c-Myct-mut报告基因质粒。取对数期HEK-293T细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制备成细胞悬液，按照5×104/孔接种至24孔板，置于培养箱中培养16～24 h。按照操作说明书，采用LipofectamineTM2000将miR-449a、c-Met或c-Myc报告质粒及内参质粒SV40共转染到HEK-293细胞中。培养24 h后按照双荧光素酶检测试剂盒操作说明，计算相对荧光强度。

2 结果

2.1 PCO-LECs、normal-LECs中miR-449a及E-cadherin、fibronectin表达比较 PCO-LECs中miR-449a及E-cadherin、fibronectin蛋白相对表达量分别为0.34±0.04，0.41±0.03、2.37±0.28；normal-LECs中分别为1.0±0.08、1.0±0.11、1.0±0.10。与normal-LECs比较，PCO-LECs中miR-449a低表达，E-cadherin低表达，fibronectin高表达(P均<0.05)。

2.2 miR-NC组、mimics组miR-449及E-cadherin、fibronectin表达比较 miR-NC组、mimics组miR-449a相对表达量分别为1.00±0.07、1.97±0.16。与miR-NC组比较，mimics组miR-449a表达高(P<0.05)，说明转染成功。miR-NC组E-cadherin、fibronectin相对表达量分别为1.0±0.08、1.0±0.11，mimics组分别为1.9±0.13、0.62±0.04，与miR-NC组比较，mimics组E-cadherin相对表达量高(P均<0.05)，fibronectin相对表达量低(P均<0.05)。

2.3 miR-449a对晶状体上皮细胞增殖和迁移的影响 miR-NC组细胞增殖活力(吸光度值)、迁移能力(穿模细胞数)分别为1.0±0.08、(118±12)个/视野，mimics组分别为0.36±0.03、(46±3)个/视野。与miR-NC组比较，mimics组细胞增殖活力、迁移能力低(P均<0.05)。

2.4 miR-449a对c-Met、c-Myc的靶向抑制作用 双荧光素酶实验结果表明miR-449a靶向作用于c-Met、c-Myc，miR-449a具有潜在靶向抑制c-Met、c-Myc 3′UTR端的能力。

3 讨论

后囊混浊是白内障术后最常见的并发症，常引起视力丢失。后囊混浊的发生与术后残留的晶状体上皮细胞迁移、增殖及EMT密切相关，但关于整个后囊混浊发生的潜在分子机制尚不清晰。研究发现，miR-181a在后囊混浊的晶状体上皮细胞中低表达，并且证明miR-181a抑制晶状体上皮细胞的增殖、迁移及EMT等过程[4]。因此miRNA在后囊混浊发病过程中具有重要的作用。同时，白内障术后残留的晶状体上皮细胞一般在术后几小时内开始增殖，并且位于晶状体表面的上皮细胞逐渐迁移到无细胞后囊中，造成后囊混浊。因此抑制晶状体上皮细胞的增殖和迁移对于预防后囊混浊的发生具有重要意义。

本研究发现，miR-449a在后囊混浊晶状体上皮细胞中低表达，表明miR-449a可能参与疾病发生过程。因此采用miR-449a mimics转染细胞，使miR-449a高表达。结果发现miR-449a高表达可抑制细胞增殖及迁移。本研究检测了EMT相关蛋白E-cadherin、fibronectin在正常晶状体上皮细胞和后囊混浊晶状体上皮细胞中的表达水平，结果发现E-cadherin在后囊混浊晶状体上皮细胞中低表达，但fibronectin高表达。这表明EMT也与后囊混浊形成密切相关，但其具体作用机制尚未清楚。本研究中通过mimics转染，PCO-LECs细胞中的miR-449a高表达，然后检测细胞中E-cadherin及fibronectin蛋白表达，评估miR-449a对细胞EMT过程的影响。结果miR-449a高表达组的E-cadherin蛋白表达升高，fibronectin蛋白表达降低。表明miR-449a高表达抑制晶状体上皮细胞EMT过程。

根据以往的研究结果，晶状体上皮细胞常表达c-Met蛋白，并且其表达在受到创伤时显著提高[8]。另外，c-Met可以激活下游的MAPK及PI3K信号通路，促进细胞增殖[9]。因此，c-Met可能通过下游的信号分子影响晶状体上皮细胞增殖、迁移和EMT过程，影响后囊混浊发生发展。同时，c-Myc高表达促进胃癌细胞的EMT过程；c-Myc mRNA在子宫内膜异位症中高表达[10]；上调c-Myc表达促进子宫内膜上皮细胞发生EMT，导致子宫内膜异位症的发生[11]。去铁胺通过调节n-Myc下游的基因NDRG1抑制癌细胞EMT[12]。因此猜测miR-449a可以调控c-Myc和c-Met的表达，影响细胞增殖、迁移以及EMT过程，从而参与晶状体后囊混浊发生。

研究表明，miR-449a靶向作用于Flot 2抑制胃癌细胞的侵袭和EMT[13]，靶向抑制多个蛋白质的表达从而抑制肝癌细胞的EMT[14]。本研究双荧光素酶实验结果表明，miR-449a靶向作用于c-Myc和c-Met，抑制二者表达。

综上所述，miR-449a过表达通过靶向抑制c-Myc和c-Met表达，从而抑制晶状体上皮细胞增殖、迁移及EMT,此为后囊混浊的预防和治疗提供了新视角。