补肾活血方对缺氧/复氧环境下bMSC内质网稳态的调控作用

黄映红，曾洁萍，张淼，谢茜

近年来，骨髓源性间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell, bMSC ）通过细胞替代和营养支持治疗缺血性脑卒中的应用越来越受到关注[1～2]。但bMSC在缺血损伤微环境下存活率低、分化失调、难以定向迁移等问题的存在限制了其临床应用。增强bMSC对损伤微环境的耐受性是解决问题的关键。研究表明，缺血缺氧等损伤因素会诱导细胞发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活未折叠蛋白反应（unfolded protein reaction,UPR），进而通过触发泛素酶体途径以减轻内质网负荷、维持内质网稳态。但当UPR介导的适应性反应仍难以减少错误折叠的蛋白质时，内质网稳态终将失衡，内质网应激将作为触发信号，最终导致细胞凋亡[3]。本研究以缺氧/复氧环境下bMSC内质网稳态失衡为切入点，旨在探讨补肾活血中药复方对bMSC的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验用动物 bMSC分离用4～5周龄SPF级SD大鼠（体重约100g～120g），雌雄不限；含药血清制备选用8～10周龄SPF级SD大鼠（体重200±20g），雌雄各半。以上实验用动物均由成都达硕生物科技有限公司提供，动物许可证：SCXK（川）2015-30。

1.1.2 实验用药物及主要试剂 补肾活血方组成：熟附片5 g，巴戟天15 g，山茱萸15 g，熟地20 g，肉苁蓉15 g，五味子15 g，麦冬15 g，石菖蒲10 g，远志10 g，丹参15 g，当归20 g，川芎10 g。购自成都中医药大学附属医院；依达拉奉注射液（昆明积大制药股份有限公司，170513）；低糖DMEM（Hyclone，SH30021.01）；胎牛血清（Cellmax，SA212.01）；MTT试剂盒（购自南京建成）；兔抗ATF6抗体（Proteintech group，24169-1-AP）；兔抗Tublin抗体（Cell Signaling Technology，2148）；BCA蛋白定量试剂盒（Cell Signaling Technology，7780）；反转录试剂盒（Aidlab，TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）；2×SYBR® Green预混液（德国DBI）。

1.2 补肾活血方含药血清的制备

补肾活血方全方用水浸泡后浓煎取汁，制备浓度为含原生药11.88、5.94、2.97 g﹒mL-1的高剂量、中剂量和低剂量水煎液。

取8～10周龄的SPF级SD大鼠40只，随机分为空白组、中药高、中、低剂量组，每组10只。中药高、中、低剂量组分别给予含原生药59.4、29.7、14.85 g﹒kg-1的补肾活血方水煎液，分别相当于按体表面积折算成人用药等效剂量4、2、1倍。空白组大鼠给予等体积生理盐水。各组均灌胃2 次/d，连续3d。第3 d最后一次给药后禁食12 h，于第4天一次性给予全天剂量，1 h后股静脉取血。全血于4℃下静置2 h，3000 rpm离心15 min，取上层清亮液体，抽滤除菌，同组血清混和，56℃条件下灭活30 min，分装，-20℃保存备用。

1.3 大鼠bMSC的分离、培养和鉴定

取4～5周龄SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后处死动物。75%乙醇浸泡10 min，无菌条件下取大鼠双侧股骨、胫骨，去除干骺端，DMEM反复冲洗骨髓腔直至骨髓腔变白，收集冲洗液，200目筛过滤，收集滤液，1200 rpm离心5 min，弃上清，向沉淀加入红细胞裂解液，冰浴15 min，1500 rpm离心5 min，收集沉淀，PBS洗涤2次，用12%L-DMEM重悬细胞，并接种于75cm2培养瓶，37 ℃、5 % CO2 及完全饱和湿度条件下孵育。48 h半量换液，72 h全量换液，以后每48h换液一次，原代细胞达到80%融合后，按1:2传代，取2～3代细胞用于后续实验。

取2～3代bMSCs接种于预置盖玻片的6孔培养板中，37℃、5 % CO2及完全饱和湿度条件下培养，制成细胞爬片。当细胞生长至70 %融合时取出玻片，行细胞免疫化学染色。CD44阳性表达，但不表达CD34的细胞为bMSC。

1.4 实验分组

取2～3代细胞接种于96孔板或6孔板，分为6组：①空白对照组：每孔加入含20%空白组血清的L-DMEM培养液；②模型对照组：每孔加入含20%空白组血清L-DMEM培养液；③中药高剂量组：每孔加入含20%高剂量补肾活血方血清的L-DMEM培养液；④中药中剂量组：每孔加入含20%中剂量补肾活血方血清的L-DMEM培养液；⑤中药低剂量组：每孔加入含20%低剂量补肾活血方血清的L-DMEM培养液；⑥依达拉奉组：每孔加入含300 μmol﹒L-1依达拉奉注射液的L-DMEM培养液。

1.5 缺氧/复氧模型制备

缺氧处理前各组细胞均更换无血清培养液，5%CO2、37℃细胞培养箱中孵育24 h，使细胞同步化。按实验分组更换相应的含药血清培养液和含药培养液，迅速将除空白对照组以外的其它几组细胞放入已预置缺氧化学催化剂（Anaero Pack，日本三菱）及缺氧指示条的缺氧盒中，密封缺氧盒，37℃条件下孵育6 h。6 h后从缺氧盒中取出培养板，5%CO2、37℃条件下再孵育2 h，终止培养。

1.6 MTT法测定细胞存活率

取3代对数生长期的bMSC，按2×104个/mL接种于96孔板（空白对照组单独铺板，另五组细胞铺于同一块96孔板），每孔0.1 mL，培养24 h，细胞贴壁生长，细胞分组及给药同1.4，每组10孔。细胞模型制备同1.5。37℃、5 % CO2及完全饱和湿度条件下孵育24 h后，每孔加入1× MTT溶液50 μL，37 ℃孵育4 h，弃孔内液体，每孔加150 μLDMSO，水平摇床振荡10 min，Tecan In finite M200 pro酶标仪 于570 nm波长处检测A570。细胞存活率=（实验组A570/空白组A570）×100%

1.7 Real-time PCR测定CHOP mRNA的相对表达量

使用 TRIZOL试剂提取细胞总RNA，用1%非变性琼脂糖凝胶电泳，然后用紫外凝胶成像系统观察RNA的完整性。所得RNA采用Aidlab公司反转录试剂盒反转录为cDNA，设计引物后对PCR进行扩增。PCR反应在analytikjena-qTOWER2.2型荧光定量PCR仪上进行，每个样品均重复三次以避免加样误差，分析方法为ΔΔCt法。

根据NCBI公布的基因序列分别设计荧光定量PCR引物，选取GAPDH作为内参基因。引物设计如下表：

表1 Q-PCR引物序列

1.8 Western blotting 测定ATF6的相对表达量

提取各组大鼠bMSC的总蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度，Western blotting检测 bMSC 的ATF6表达水平，ATF6一抗1:500稀释，ɑ-Tublin一抗1:1000稀释，二抗 1:1000稀释。扫描PVDF膜上各条带，Image J分析各条带的平均光密度值，取目的蛋白与内参ɑ-Tubulin平均光密度值的比值，表示bMSC内ATF6的相对表达量，并比较各组细胞ATF6相对表达量的差异。

1.9 统计分析

统计分析采用SPSS 22.0软件进行处理，计量数据均以±S表示，均数间的两两比较采用成组t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1bMSC形态观察

原代有核细胞48～72 h完全贴壁，贴壁细胞呈梭形，细胞核为卵圆形。原代细胞于6～8 d进入对数生长期，细胞克隆化生长，形成大小不一的集落，12～15 d达到80%～90%融合。传代细胞呈长梭形，24 h左右完全贴壁，4～5 d进入对数生长期。(见图1)

图1 倒置显微镜下bMSC的形态特征（100×）

2.2 补肾活血方对缺氧/复氧环境下bMSC存活率的影响

与空白对照组比较，模型对照组bMSC存活率明显降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，补肾活血方高、中、低剂量组和依达拉奉组bMSC存活率显著增高（P＜0.05或P＜0.01）。（见表2）

表2 各组bMSC存活率的比较（x±S ，n=10）

2.3 补肾活血方对缺氧/复氧环境下bMSC中ATF6表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组bMSC内ATF6相对表达量显著增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，补肾活血方高剂量组bMSC内ATF6相对表达量显著降低（P＜0.01）。（见图2）

注：与空白对照组比较：*P＜0.05；与模型对照组比较：P＜0.05，P＜0.01

注：C代表空白对照组，M代表模型对照组，D代表中药低剂量组，Z代表中药中剂量组， G代表中药高剂量组，E代表依达拉奉组

2.4 补肾活血方对缺氧/复氧环境下bMSC中CHOP mRNA表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组bMSC内CHOP mRNA的相对表达量显著增高（P＜0.01）；与模型对照组比较，补肾活血方高剂量组、中剂量组及依达拉奉组bMSC内CHOP mRNA的相对表达量显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。（见图3）

注：与空白对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较：P＜0.05，P＜0.01

3 讨论

bMSC是来源于骨髓的一种具有跨胚层分化潜能的成体干细胞，其在缺血损伤脑组织中的定植分化、旁分泌等效应有助于修复受损组织[4～5]。目前认为，bMSC所具有的内在分化程序、所处微环境中的神经营养因子、细胞外基质、黏附分子等因素与其增殖、分化密切相关。但脑缺血再灌注后，各种复杂的原发和继发事件(如炎症因子的释放、神经血管单元的受损和细胞死亡、各种损伤和抗损伤事件的对抗等)严重影响了bMSC的存活。因此，增强bMSC对损伤微环境的耐受性是干细胞研究中不容忽视的环节。

本研究选用补肾经典方—地黄饮子配伍活血化瘀常用药物组成补肾活血方。地黄饮子出自刘河间《黄帝素问·宣明论方》，为临床治疗缺血性脑损伤的有效方[6～7]。方中附子、巴戟天、肉苁蓉补肾阳，山茱萸、熟地填肾精，麦冬、五味子补阴，当归、丹参、川芎养血活血，菖蒲、远志化痰开窍，全方阴阳并补，水火相济，共奏补肾填精、祛瘀化痰之功。实验研究亦表明地黄饮子具有明确的神经保护作用，其机制可能为改善HPA轴的紊乱、抗氧化和清除自由基、抑制神经元凋亡、促进内源性神经干细胞增殖等[8～10]。另有研究证实，地黄饮子含药血清孵育bMSC，能显著提高bMSC移植对缺血性脑卒中的治疗效果[11～12]。但有关地黄饮子对缺血损伤微环境中bMSC的保护作用及机制研究，还鲜有文献报道。

内质网是蛋白质翻译后修饰、折叠组装的场所。缺血、缺氧等病理因素破坏内质网稳态，则会引发ERS，表现为大量错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网聚集，并启动从内质网到细胞质和细胞核的一系列信号转导。内质网膜上存在三类感受器：蛋白激酶样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、激活作用转录因子-6（activating transcription factor 6，ATF6）、跨膜蛋白激酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）。早期ERS通过介导三条UPR信号通路，即PERK通路、ATF6通路、IRE1通路，以抑制蛋白质合成、减轻内质网负荷，或提高蛋白质折叠能力，或通过内质网相关性蛋白质降解途径清除未折叠和错误折叠蛋白质，以恢复内质网稳态，使细胞继续存活。但如细胞遭受的刺激过强或ERS持续时间过长，细胞难以维持或重建内质网稳态时，内质网就会作为凋亡信号的发起点[13～14]。内质网应激信号通路中重要信号分子—CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)可通过激活下游基因如DOCs（downstream of CHOP）或caspase-1诱导细胞凋亡，故CHOP的表达上调是ERS诱导凋亡的关键环节[15]。因此，阻断ATF6通路、下调CHOP的表达，减轻因缺血缺氧导致的内质网应激，进而抑制细胞凋亡，是神经保护药物治疗缺血性脑损伤的重要机制[16]。

本研究结果显示，缺氧6 h/复氧2 h诱导下，bMSC存活率明显降低；与此同时，bMSC中内质网应激相关基因ATF6、CHOP的表达丰度明显增加。这一结果提示模拟缺血/再灌注损伤导致bMSC内质网应激发生，而bMSC存活率的降低与持续存在的ERS密切相关。给予补肾活血方含药血清处理可显著增强bMSC对缺氧损伤环境的耐受性，提高细胞存活率，该方的细胞保护作用机制可能为抑制bMSC内质网应激，从而阻断细胞凋亡。