四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型造模要素及中医药防治的数据挖掘研究

胡凤娇，宋文杰，王张，梁源，刘光丽

肝病是威胁我国人民健康的重大疾病之一，具有发病率高、病程长、难以彻底治愈、病情反复发作的特点。肝病的对症药物治疗是临床上的常用手段，肝病种类很多，多会引起肝脏炎症，致不同程度的肝损伤，因此肝损伤动物模型在肝病机理研究及药物研发中非常重要。CCL4是常见的制作肝损伤动物模型的造模试剂，其成模率高、重复性好。因文献报道的造模参数参差不齐，相差过大，导致模型的成功率差异很大，故本文对国内20多年来利用CCL4致小鼠肝损伤动物模型的造模要素及其中医药防治的实验研究结果进行数据挖掘和分析，为提高造模效率及评价中医药防治肝损伤疾病的疗效提供定量的方法学参考。

1 材料

在中国知识基础设施工程(CNKI)、维普数据库中，收集1990年-2016年期间（27年）研究CCL4致小鼠肝损伤动物模型的文献，对文献的完整程度、应用价值进行初步评价，最终纳入393篇文章。

2 方法

2.1 信息录入

应用Excel软件，录入文章题目，动物种别、体重、性别，四氯化碳所用稀释液、浓度、给予量、给予部位、给予次数，造模与给药先后关系，造模后处死间隔，受试药物名称、药物组成、阳性药，肝组织取材部位、肝组织病理描述，测试指标等信息。

2.2 数据库构建

制作《CCL4致小鼠急性肝损伤的造模要素数据挖掘表》。

2.3 统计和分析

对录入的每项数据进行统计和分析，定量归纳造模要素。

3 结果

3.1 动物

3.1.1 种别 多为KM小鼠，极少数使用ICR小鼠。

3.1.2 性别 主要为雄性。其原因可能是男性生活压力较大，经常熬夜、酗酒、工作疲劳，且在动物实验研究中，雄性鼠对黄曲霉毒素等致癌物更加敏感，更容易发生肝癌。

3.1.3 购进时体重 最常使用的体重为20±2 g（61.83%，意为纳入文章中出现的频率，后同），其次为22±2 g（4.58%）、19±1 g（3.82%）、22.5±2.5 g（3.56%）等。

3.2 造模

3.2.1 四氯化碳的稀释液 常用者为花生油（41.73%）、橄榄油（18.58%）、豆油（7.13%）、植物油（5.85%）、色拉油（3.05%）、液体石蜡（2.80%）等。

3.2.2 四氯化碳的稀释浓度 常见者为0.1%（35.62%）、0.2%（13.49%）、0.15%（7.12%）、1%（7.12%）、0.5%（6.87%）、0.08%（4.83%）、10%（4.07%）等。

3.2.3四氯化碳的给予体积 常见者为10 mg﹒kg-1（67.68%）、20 mg﹒kg-1（8.65%）、5 mg﹒kg-1（8.40%）、2 mg﹒kg-1（1.27%）等。

3.2.4 四氯化碳的给予剂量 常见者为0.01 mg﹒kg-1（27.74%）、0.02 mg﹒kg-1（15.52%）、0.05 mg﹒kg-1（8.14%）等。

3.2.5 四氯化碳给予部位 常见者为腹腔注射（84.73%）、灌胃（8.40%）、皮下注射（6.11%）。

3.2.6 四氯化碳给予次数 绝大多数文献选择一次性给予造模（95%）。

3.2.7 造模后动物处死时间 多在12～24 h之间，最常见者为24 h（30.28%）、16h（27.23%）、18h（9.16%）、20h（5.85%）、12h（5.09%）。因此阶段处于肝损伤巅峰期，处死时间太短，肝损伤不完全；时间太长，已经造成的肝损伤开始修复。

3.3 评价指标

3.3.1 常见生化指标 详见表1。造模成功后，血清中的ALT、AST、MDA、肝指数、TNF-α、ALP、NO、LDH、TG、TBIL、IL-6、TGF-β1、NF-κB、IL-1β均上升，SOD、GSH-PxGSH、CAT、ALB、T-AOC、TP、P450、Cytκ.b5、IL-10均下降。ALT、AST是肝脏功能的重要检测指标，其变化与肝脏受损程度成正相关。

表1 指标及其变化趋势

核因子 NF-κB ↑ 3 ↓ 3白介素-10 IL-10 ↓ 3 ↑ 3白介素-1β IL-1β ↑ 3 ↓ 3白介素-2 IL-2 ↑ 2 ↓ 2一氧化氮合酶 NOS ↑ 2 ↓ 2细胞色素 Cyt.b5 ↓ 2 ↑ 2肝糖原 —— ↑ 1 ↓ 1↓1↑1肝脏蛋白 —— ↓ 2 ↑ 2肝细胞生长因子 HGF ↓ 2 ↑ 2细胞间黏附分子 1ICAM-1/CD54↑2↓2谷胱甘肽还原酶 GR ↓ 2 ↑ 2总胆固醇 TC ↑ 2 ↓ 2胆碱酯酶 ChE ↓ 2 ↑ 2肝功能白球比例 (A/G) ↓ 2 ↑ 2 caspase-3 —— ↑ 2 ↓2谷氨酰转肽酶 GGT ↑ 2 ↓ 2 β-半乳糖苷酶 β-Gal ↑ 1 ↓ 1硫代巴比妥酸反应产物 TBARS ↑ 1 ↓ 1胆红素 BIL ↑ 1 ↓ 1肝药酶 —— ↓ 1 ↑ 1游离脂肪酸 FFA ↑ 1 ↓ 1肝指酶 HL/HTGL↑ 1 ↓ 1球蛋白 GLB/G - 1 - 1山梨醇脱氢酶 SDH ↑ 1 ↓ 1血尿素氮 BUN ↑ 1 ↓ 1白介素-8 IL-8 ↑ 1 ↓ 1脂质过氧化物 LOOH ↑ 1 ↓ 1肝细胞人体抑癌基因 P53 ↑ 1 ↓ 1 Toll样受体 TLR4 ↑ 1 ↓ 1直接胆红素 DBIL ↑ 1 ↓ 1肝再生增强因子 ALR ↓ 1 ↑ 1羟脯氨酸 Hyp ↑ 1 ↓ 1 Bcl-2相关x蛋白 Bax ↑ 1 ↓ 1淋巴细胞瘤一2蛋白 Bel-2 ↓ 1 ↑ 1

3.3.2 其它不常见生化指标 详见表1。IL-2、NOS、Cyt.b5、肝糖原、肝脏蛋白、HGF、CD54、GR、TC、ChE、A/G、caspase-3、GGT、β-Gal、TBARS、BIL、肝药酶、FFA、HL/HTGL、GLB、SDH、BUN、IL-8、LOOH、P53、TLR4、DBIL、ALR、Hyp、Bax、Bel-2等。

3.3.3 肝组织变化

3.3.3.1肝组织取材部位 大多数取整肝，其余取材部位包括肝左叶、肝右叶、最大肝叶以及肝小叶。

3.3.3.2 肝组织外观大体描述 正常组小鼠的肝脏结构正常，外观呈红褐色，质地软而富有弹性，无变性，坏死等病理变化；模型组小鼠的肝脏常表现为质地较脆，颜色灰暗，表面粗糙有许多结节，肝脏明显肿大，淤血，肝脏表面有点状出血。

3.3.3.3 肝组织病理学 以肝细胞坏死以及炎性细胞浸润最为常见，其它病变包括水样病变、气球样病变、肝细胞结构紊乱、脂肪形变、肝细胞索排列紊乱、肝脏表面病变等。

3.4 药物防治

3.4.1 给药方案 平均为14天。给药时间常见者有先给药后造模（79.64%）、造模同时给药（11.96%）、先造模后给药（5.60%）、仅造模（2.04%）、先给药后造模给药再同时进行（0.25%）。

3.4.2 阳性对照药 主要有联苯双酯（49.36%）、水飞蓟素（7.89%）、甘利欣（2.80%）、维生素E（1.02%）、益肝灵片（1.02%）、马洛替酯（0.51%）、谷胱甘肽（0.51%）、护肝片（0.51%）、肝泰乐（0.51%）、秋水仙碱片（0.25%）等。

3.4.3 中药

3.4.3.1 复方制剂 包括栀子柏皮汤、降脂利肝方、复方丹参注射液、复方苦参冲剂、朝医方、二门五味汤、八味獐牙菜散、柴芩清肝胶囊等。

3.4.3.2 中药材 涉及96种中药材（括号内为文章篇数），即黄芪（17）、甘草（16）、丹参（14）、茵陈（14）、柴胡（13）、黄芩（13）、五味子（10）、栀子（9）、白花蛇舌草（7）、决明子（7）、郁金（7）、大青叶（7）、白术（6）、灵芝（6）、炒白术（6）、虎杖（5）、三七（5）、党参（4）、白芍（4）、泽泻（3）、紫草（3）、金钱草（3）、大枣（3）、葛根（3）、山楂（3）、垂盆草（3）、龙胆（3）、鳖甲（3）、绞股蓝（3）、胡黄连（2）、大黄（2）、黄柏（2）、小田基黄（2）、半枝莲（2）、生姜（2）、木香（2）、何首乌（2）、山豆根（2）、鸡血藤（2）、女贞子（2）、香附（2）、马鞭草（2）、何首乌（2）、石见穿（2）、川芎（2）、赤芍（2）、石斛（2）、波棱瓜子（2）、麦冬（2）、茯苓（2）、焦山楂（2）、鸡内金（1）、海金沙（1）、板兰根（1）、清半夏（1）、麦芽（1）、陈皮（1）、防风（1）、八月扎（1）、云芩（1）、荷叶（1）、桃仁（1）、陆英（1）、牡丹皮（1）、小花清风藤（1）、仙灵脾（1）、猫爪草（1）、延胡索（1）、土茯苓 （1）、薤白（1）、蚤休（1）、车前草（1）、焦麦芽（1）、焦神曲（1）、法半夏（1）、乌梅（1）、红参（1）、苦参碱（1）、太子参（1）、叶下珠（1）、刺梨汁粉（1）、六月雪（1）、鸡骨草（1）、牛黄（1）、苍术（1）、降香（1）、天门冬（1）、芍药（1）、獐芽菜（1）、唐古特乌头（1）、矮丛风毛菊（1）、短管兔儿草（1）、节裂角茴香（1）、小檗皮（1）、菊花（1）、桔梗（1）。

3.4.3.3 黄酮类 包括紫心甘薯总黄酮、玉郎伞黄酮、野菊花总黄酮、小叶黑柴胡茎叶总黄酮、相思藤总黄酮、忍冬叶总黄酮、马鞭草总黄酮、鸡血藤总黄酮、黄蜀葵花黄酮、黄芩茎叶总黄酮、红景天总黄酮、葛根总黄酮、甘草类黄酮、杜仲总黄酮、大豆异黄酮、大豆异黄酮、穿破石总黄酮、白花蛇舌草黄酮、银杏叶提取物等。

3.4.3.4 苷类 包括白首乌C21甾体酯苷、紫丁香苷、竹节参总皂苷、特女贞苷、羟基积雪草苷、木通皂苷D、毛蕊花苷固体脂质纳米粒、芒果苷滴丸、罗汉果甜苷、京尼平甙、黄芩苷、黄苠总甙、鬼针聚炔苷、大豆皂苷、橙皮苷等。

3.4.3.5 多糖类 包括窑归多糖、羊肚菌胞内多糖、仙人掌多糖、铁棍山药多糖、酸枣多糖、肉苁蓉多糖、龙葵多糖、壳寡糖I和壳寡糖Ⅱ、蕨麻多糖、金顶侧耳多糖、绞股蓝多糖、姬松茸多糖、霍山石斛多糖、灰树花多糖、黄芪多糖、花生粗多糖、归芪多糖、大枣多糖、纯化当归多糖、北五味子粗多糖、蚌肉多糖等。

3.4.4 有效性评价指标 详见表1。给药后，血清及肝脏中的ALT、AST、MDA、肝指数、TNF-α、ALP、NO、LDH、TG、TBIL、IL-6、TGF-β1、NF-κB、IL-1β均上升。给药组小鼠的肝脏损伤（外观和镜下）程度均有不同程度的减轻，且存在剂量依赖性。

4 讨论

研究表明，肝损伤的基本要素为细胞死亡。细胞死亡又分为坏死和凋亡。细胞坏死是细胞生物膜系统的完整性被破坏，导致胞质液的酶类释出（如：ALT、AST），激起炎症反应，炎症细胞、细胞因子、毒性氧基团的出现会进一步损伤邻近组织。细胞凋亡则不会引起炎症反应，但可以激活转化生长因子β，促进纤维化，凋亡的本质虽为机体保证正常细胞转换的生理过程，但凋亡过多或过少均可造成病理现象。坏死和凋亡的共同之处在于线粒体结构的改变，失去功能。线粒体功能衰竭形成坏死；线粒体释放出一些凋亡诱发因子造成凋亡。外来毒素或有害因子剂量较低时，以凋亡为主，剂量较高时，以坏死为主。但不十分绝对，在考虑治疗方案时，应同时采取防止和阻断坏死与凋亡双管齐下的方针。

而本文未将小鼠肝组织病变程度与给予剂量进行相关性分析，若结合分析，预计可通过控制四氯化碳的给予剂量进而控制肝脏的损伤病变程度，真正达到定量造模的要求。