姜黄素对心肌细胞缺血再灌注损伤的作用及机制研究

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缺血再灌注损伤(IRI)是目前临床尚未解决的一个复杂问题，对心血管系统有害，是导致心脏衰竭，心脏手术和心肌梗死后发病率和死亡率高的主要原因[1-2]。IRI是指在病理损伤过程中，心肌细胞在一段时间内出现缺血，血液恢复供应后，出现较灌注之前更严重的损伤，如出现心律失常、心肌梗死面积加大等，许多因素可导致IRI。西医认为心肌缺血再灌注损伤与Ca2+超载，细胞凋亡、坏死和自噬，能量代谢出现障碍，微血栓的形成及血小板的聚集，炎症反应等有关。中医根据其病位及胸闷、胸痛等临床表现，将该病归属于“胸痹”“心悸”等范畴。

姜黄素(Cur)1，7-双(4-羟基-5-甲氧基苯基)-1，6庚二烯-3，5-二酮(二糠基甲烷)，是一类从姜黄根茎中分离出的天然产物(姜黄)，该草药已广泛应用在中国和南亚[3-5]。姜黄是姜科植物，其根茎可入药，气香特异，味苦、辛，性温，归脾、肝经；具有破血行气、通经止痛功能，用于胸胁刺痛、胸痹心痛、痛经经闭、癥瘕、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛[6]。姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基等多方面药理作用。有研究显示，Cur可减轻脑、肾、视网膜、肝脏和结肠的缺血再灌注损伤[7-10]。有相关研究报道，姜黄素后处理通过激活预存活信号通路减轻IR损伤[9，11]。沉默信息调节因子3(SIRT3)[12-15]在肿瘤、炎症、卡路里限制而延长寿命及心肌肥厚等方面有相关研究，其对抗氧化应激从而发挥保护作用，但姜黄素能否通过SIRT3保护心肌细胞IRI目前缺乏相关研究。本研究旨在探讨姜黄素预处理对心肌细胞IRI模型的保护作用及SIRT3所介导的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 姜黄素、MTT(美国Sigma公司)；BCl-2，Bax，Sirt3，β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)；3-TYP(由重庆大学IDRC创新药物研究中心合成)；二抗(北京中山科技有限公司)；TUNEL试剂盒(德国Mannheim公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞的制备和模拟IR治疗 使用先前报道的方法H9C2的原代培养物培养。将心肌细胞暴露于含有以下试剂的缺血缓冲液：NaCl 137 mmol/L，KCl 12 mmol/L，MgCl20.49 mmol/L，CaCl2·2H2O 0.9 mmol/L和Hepes 4 mmol/L。该缓冲液补充有以下化合物：脱氧葡萄糖10 mmol/L，连二硫酸钠0.75 mmol/L和乳酸盐 20 mmol/L。缓冲液pH为6.5，并将细胞潮湿的细胞培养箱(21%O2，5%CO2，37 ℃)中孵育1.5 h。在正常空气和培养基条件下再灌注4 h。

1.2.2 选择姜黄素浓度及细胞培养与处理 观察Cur预处理是否减轻IRI心肌细胞，将心肌细胞随机分为对照组、IR组、Cur(2.5 μmol、5 μmol、10 μmol)+IR组(n=8)。前期研究MTT结果表明，5 μmol和10 μmol Cur对细胞活力的影响差异无统计学意义(P>0.05)，因此选择5 μmol Cur用于本研究。观察Cur预处理后SIRT3对IRI心肌细胞的保护作用，按随机区组法分为IR组，Cur+IR组，3-TYP+IR组，Cur+3-TYP组+IR组。

H9C2在补充有10%胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素的DMEM培养基(Hyclone，UT，USA)中，在37 ℃，5%CO2和95%空气中培养。在DMSO中制备姜黄素储备溶液，并在实验之前立即用培养基稀释。DMSO(0.01%)用作对照组，进行处理后，获取细胞用于进一步分析。

1.2.3 细胞存活率测定 通过MTT实验方法评估H9C2心肌细胞活力。预处理的细胞用PBS洗涤后，加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶于无酚红DMEM中的溶液，37 ℃孵育4 h。使用分光光度计(SpectraMax 190，Molecular Device，USA)在490 nm测定结果，细胞存活率通过光密度(OD)值表达。

1.2.4 细胞凋亡实验 使用原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL测定分析细胞凋亡。根据说明书使用双染色技术，将H9C2在4%多聚甲醛中固定24 h后，进行TUNEL测定以染色凋亡细胞的细胞核(绿色)，并使用4’6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色所有核(蓝色)。凋亡指数表示为阳性染色的凋亡H9C2数目/H9C2总数×100%。

1.2.5 细胞内SOD，GSH-Px和MDA浓度测定 使用试剂盒测定细胞内SOD，GSH-Px和MDA活性。所有实验按说明书进行。

1.2.6 蛋白质印迹分析 将H9C2样品在含有50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.3)，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L二硫苏糖醇，1%Triton X-100和1%蛋白酶的裂解缓冲液抑制剂混合物中。将12 000 g裂解物离心15 min，得到上清液转移至新管中并在-70 ℃下储存。使用Bradford蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。将膜在含有5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水和吐温20(TBST，pH 7.6)中封闭1 h，之后在4 ℃下针对SIRT3(1∶500稀释)，BCl-2，Bax，SOD2和β-actin(1∶1 000稀释)抗体中孵育过夜。印迹用TBST洗涤，之后在室温下用合适的第二抗体(1∶5 000稀释)探测90 min，并用TBST洗涤。通过化学发光检测蛋白质条带并用Quantity One软件包(West Berkeley，CA，USA)测定。对照组的结果定义为100%。

1.3 统计学处理 采用Graphpad Prism-5统计软件(La Jolla，CA，USA)进行数据分析。数据以平均值±标准误(SEM)表示。组间比较采用单因素方差分析(SPSS13.0)。所有组分析用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度姜黄素预处理对细胞存活率的影响 与IR组比较，Cur(2.5 μmol、5 μmol、10 μmol)预处理显著增加细胞存活率(P<0.01)；与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不同浓度Cur组组间比较，Cur(5 μmol、10 μmol)与Cur(2.5 μmol)组比较显著增加细胞活力(P<0.01)。详见图1。

2.2 各组IRI后对心肌细胞的凋亡指数和蛋白表达的影响 与IR组比较， Cur预处理显著降低凋亡指数(P<0.01)；与Cur+IR组比较，Cur+3-TYP+IR组凋亡指数显著升高(P<0.01)，详见图2、图3。与IR组比较，Cur预处理组BCl-2蛋白浓度升高(P<0.01)，BAX蛋白浓度减低(P<0.01)；BAX蛋白浓度增高(P<0.01)。与Cur+IR组比较，Cur+3-TYP+IR组BCl-2蛋白浓度减低(P<0.01)，与IR组比较，Cur+IR组SIRT3蛋白浓度升高(P<0.01)，AcSOD蛋白浓度减低(P<0.01)。Cur+3-TYP+IR组、3-TYP+IR组SIRT3蛋白浓度降低(P<0.01)；与Cur+IR组比较，Cur+3-TYP+IR组、3-TYP+IR组SIRT3蛋白浓度减低(P<0.01)；与Cur+IR组比较，Cur+3-TYP+IR组AcSOD蛋白浓度增高(P<0.05)，3-TYP+IR组AcSOD蛋白浓度增高(P<0.01)。详见图4、图5。

注：与对照组比较，**P<0.05 ；与IR组比较，##P<0.01；与 Cur2.5 μmol组比较，&&P<0.01。

图2 各组缺血再灌注损伤心肌细胞的凋亡指数比较

注：与对照组比较，**P<0.05 ；与IR组比较，##P<0.01；与Cur+IR组比较，&&P<0.01。

注：与IR组比较，**P<0.01；与Cur+IR组比较，##P<0.01。

注：与IR组比较，**P<0.01；与Cur+IR组比较，##P<0.01。

2.3 Cur和3-TYP预处理对IR损伤的心肌细胞氧化损伤指标的影响 与IR组比较，Cur+IR组和Cur+3-TYP+IR组SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.01)；与Cur+IR组比较，Cur+3-TYP+IR组和3-TYP+IR组SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.01)。与IR组比较，Cur+IR组MDA水平显著降低(P<0.01)。与Cur+IR组比较，Cur+3-TYP+IR组和3-TYP+IR组MDA水平显著增加(P<0.01)。详见图6。

注：与IR组比较，**P<0.01；与Cur+IR组比较，##P<0.01。

3 讨 论

有文献报道，姜黄素在抗氧化过程中通过调控核因子E2相关因子2(Nrf2-ARE)[16]、核因子-κB(NF-κB)[17]、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶/活性氧(ROS)[18]、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/内皮细胞性一氧化氮合酶(eNOS)[19]和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[20]等多条信号传导通路，激活相应信号通路转导分子，调控功能基因的表达水平，增加或抑制多种蛋白表达，改善氧化应激，发挥抗氧化作用，改善炎症、癌症、心血管及神经系统等多种疾病临床症状，然而SIRT3信号通路是否对该过程有保护作用尚未确定。

SIRT3是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙酰化酶，是唯一与人类老化相关的Sirtuins家族成员，作为细胞内多个通路的关键调控因子，SIRT3成为心血管疾病相关领域研究的新方向。在心血管系统基础研究中，Qiu等[12]实验证明SIRT3通过激活AcSOD减少细胞ROS。Porter等[14]进一步证实SIRT3敲除小鼠心脏在缺血再灌注损伤过程中，其功能修复能力减低和心肌梗死面积扩大，SIRT3缺失可提高心肌缺血再灌注损伤的敏感性。Sundaresan等[21]发现，SIRT3通过激活MnSOD、Foxo3a水平减轻细胞ROS抑制心肌肥厚。SIRT3基因敲除小鼠对心肌肥厚和纤维化高度敏感，过表达SIRT3可拮抗应激介导的细胞凋亡，保护心肌[22]。因此，本研究推测姜黄素在心肌细胞缺血再灌注损伤过程中可能是SIRT3通过激活AcSOD水平减轻细胞氧化应激损伤发挥保护作用的。

本研究结果显示，Cur+IR组BCl-2的表达高于IR组、3-TYP+IR组、Cur+3-TYP+IR组；IR组BAX表达高于Cur+IR组、3-TYP+IR组、Cur+3-TYP+IR组，说明Cur促进抗凋亡蛋白BCl-2表达，减少促凋亡蛋白Bax表达抑制心肌细胞凋亡。氧化应激指标测定，Cur+IR组SOD、GSH-Px表达高于IR组、3-TYP+IR组、Cur+3-TYP+IR组；IR组MDA表达高于Cur+IR组、3-TYP+IR组、Cur+3-TYP+IR组，说明Cur通过抗氧化应激损伤而保护心肌细胞。Cur+IR组SIRT3表达高于IR组、3-TYP+IR组、Cur+3-TYP+IR组，IR组AcSOD表达高于Cur+IR组、3-TYP+IR组、Cur+3-TYP+IR组，说明SIRT3通过上调AcSOD对损伤心肌细胞起保护作用。因此推测姜黄素通过上调AcSOD促进SIRT3表达发挥抗氧化应激损伤，保护受损的心肌细胞。

综上所述，本研究提示姜黄素预处理心肌细胞IRI模型，SIRT3表达水平增高，AcSOD表达水平、MDA、BAX表达水平降低，姜黄素通过促进SIRT3表达抗氧化应激损伤保护心肌细胞，可作为心脏手术和缺血性心脏病中心肌IRI治疗的药物，为进一步的临床研究提供依据。

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