通过脉管相关标志物表达的对比探讨术中纳米炭甲状旁腺 负显影机制*

陈翠花 程若川 赵川 刁畅 苏艳军 刘文 潘笑宇

近几年，临床上实施甲状腺手术时，常采用纳米炭混悬液显影示踪。纳米炭是一种具有淋巴趋向性的显影剂，向甲状腺腺体内注射时甲状腺迅速黑染，其引流的淋巴管以及淋巴结黑染，而甲状旁腺始终保留原色，与黑染的甲状腺对比呈“负显影”［1-4］。普遍解释为甲状旁腺与甲状腺各自有一套解剖上互不相通的淋巴系统［1，3-4］。然而，在后续的临床观察中发现向甲状旁腺腺体内注射纳米炭混悬液，甲状旁腺仅局部黑染，甲状腺不被黑染。本文提出甲状旁腺可能存在淋巴系统先天缺失或发育不全之假说。目前，关于组织器官毛细淋巴管形态学的研究，免疫组织化学法为首选方法。有研究提示D2-40、LYVE-1是淋巴管内皮细胞较为特异的标志物，其中D2-40对淋巴管内皮具有更高的特异性［5-6］。CD31、CD34为血管内皮细胞较为理想的标志物［7-8］。因而，本研究采用淋巴管特异性标志物D2-40、LYVE-1检测淋巴管，血管标志物CD31、CD34检测血管，通过脉管相关标志物表达的对比，探讨甲状旁腺是否存在淋巴系统以及甲状腺术中纳米炭甲状旁腺“负显影”的主要机制。

1 材料与方法

1.1 材料

收集昆明医科大学第一附属医院病理科组织标本62例，包括实施甲状腺手术时切除的正常甲状旁腺组织石蜡块45例，因甲状旁腺自身病变而手术切除的甲状旁腺腺瘤组织石蜡块10例及甲状旁腺癌组织石蜡块7例。统计62例石蜡块的患者的一般资料，包括年龄、性别。本文研究通过昆明医科大学第一附属医院伦理委员会审查批准（2016伦理L第46号）。10例正常甲状腺组织标本作为阳性对照组，术中收集正常甲状腺组织标本（冰冻证实无病变）。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2 方法

1.2.1 试验分组 根据甲状旁腺病理类型分组正常甲状旁腺组（n=45）、甲状旁腺腺瘤组（n=10）、甲状旁腺腺癌组（n=7）。根据意外切除正常甲状旁腺在病理组织标本中的位置分组。由病理科资深主任医师重新阅片，从切片层面按照朱精强等［9］提出的甲状旁腺分型方法，分为：A型甲状旁腺（贴近或部分嵌入甲状腺组织或完全位于甲状腺组织内）20例；B型甲状旁腺（贴近淋巴结组织或胸腺组织或位于胸腺组织内）25例。

1.2.2 标本制备 62例甲状旁腺组织石蜡块，分别3 μm厚切片再用二甲苯常规脱蜡、梯度酒精水化、抗原修复等步骤处理；10例正常甲状腺组织标本经4%甲醛固定、石蜡包埋，取3 μm厚切片等步骤处理。

1.2.3 免疫组织化学染色 将以上组织标本的切片分别进行免疫组织化学染色。免疫组织化学采用SP法，SP通用试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司，严格按照SP检测试剂盒说明书所示步骤操作。所用抗体D2-40、CD31、CD34为工作液（购于福州迈新生物技术开发公司）和LYVE-1（稀释浓度1:100，购于北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验（选用χ2检验或配对χ2检验法）。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺与甲状旁腺脉管阳性率

10例正常甲状腺组织中，D2-40、LYVE-1分别染色均可见阳性淋巴管，且淋巴管位于甲状腺滤泡间隙、被膜区或门脉区，呈网状分布（表1，图1A），CD31、CD34分别染色均可见阳性血管，分布特点与淋巴管相似。

62例甲状旁腺组织中：CD31有效染色58例，其中50例可见阳性血管，CD34有效染色60例，均可见阳性血管，且阳性染色的血管呈弥漫或网状分布；D2-40有效染色59例，其中17例可见阳性的淋巴管；LYVE-1有效染色58例，其中23例可见阳性的淋巴管，且阳性者均表现为全视野下可见的单个或少数棕黄色淋巴管，多局限性分布于脉管区或被膜区，腺体实质内少见（图1，2）。故难以通过计数淋巴管密度［10］进行比较分析，遂计算脉管特异性标志物的阳性表达率，即甲状旁腺组织阳性染色淋巴管的比例及阳性染色血管的比例进行比较分析（表1～3）。甲状旁腺与甲状腺血管标志物阳性表达率差异无统计学意义（P=0.099），而淋巴管阳性表达率差异具有统计学意义（P＜0.001，表1）。

表1 甲状旁腺与甲状腺淋巴管及血管相关标志物阳性表达率的比较

2.2 甲状旁腺淋巴管特异性标志物的阳性表达率与临床病理因素的关系

甲状旁腺淋巴管阳性率与性别（D2-40：P=0.753；LYVE-1：P=0.364）、年龄（D2-40：P=0.089；LYVE-1：P=0.622）无关，与其病理类型相关。正常甲状旁腺与甲状旁腺癌的阳性率比较差异具有统计学意义（D2-40：P=0.001；LYVE-1：P=0.044），甲状旁腺瘤与甲状旁腺癌的阳性率比较，差异具有统计学意义（D2-40：P=0.005；LYVE-1：P=0.005），而正常甲状旁腺与甲状旁腺瘤阳性率比较，差异无统计学意义（D2-40：P=0.920；LYVE-1：P=0.533，表2）。

A型甲状旁腺与B型甲状旁腺淋巴管阳性率比较，差异无统计学意义（D2-40：P=0.957；LYVE-1：P=0.536，表3）。

淋巴管特异性标志物D2-40、LYVE-1分别染色甲状旁腺组织，其淋巴管阳性表达率比较，差异无统计学意义（表4，P=0.286）。

图1 正常甲状旁腺及病变甲状旁腺D2-40染色（IHC×100）

图2 正常甲状旁腺组织染色（IHC×200）

表2 甲状旁腺淋巴管相关标志物阳性表达率与临床病理变量的关系

表3 甲状旁腺淋巴管相关标志物阳性表达率与甲状旁腺分型的关系

表4 甲状旁腺组织不同淋巴管标记物染色淋巴管阳性表达率比较

3 讨论

3.1 甲状旁腺淋巴管研究分析

甲状旁腺是体积较小的富含血管的内分泌器官。然而，关于甲状旁腺是否存在淋巴系统尚无明确定论（见表5）［11～14］。本研究采用淋巴管特异性标志物D2-40、LYVE-1进行检测，血管内皮标志物CD31、CD34检测相鉴别。研究发现，甲状腺组织富含血管和淋巴管，CD31、CD34分别染色均可见阳性表达的血管呈网状分布；D2-40、LYVE-1分别染色，亦可见阳性表达的淋巴管呈网状分布。然而，在甲状旁腺组织中CD31、CD34分别染色，可见阳性表达的血管呈网状分布，D2-40、LYVE-1分别染色，仅少部分甲状旁腺可见D2-40和（或）LYVE-1阳性表达的单个或少数淋巴管，且一般位于脉管区或被膜区，大部分脉管管腔结构阴性表达，而该部分脉管结构对应CD31、CD34染色阳性表达。表明甲状旁腺富含血管，但甲状旁腺仅小部分存在少数淋巴管。进一步结合临床病理资料统计分析显示，甲状旁腺含有淋巴管的概率与年龄、性别、甲状旁腺分型无关，与甲状旁腺发生腺瘤病变无关，而与甲状旁腺恶性病变有关，且恶性者淋巴管出现概率明显增高。本研究结果与Garcia等［13］相近，Pezerovic-Panijan 等［12］应用H&E、PAS染色法，在光学显微镜下观察甲状旁腺微脉管得出的结果与本研究部分结果不一致；另一方面，Jin等［14］采用特异性免疫组织化学法，因研究例数有限其结果与本研究也不一致。有文献指出［15-16］，本研究采用不同检测方法和不同标记物检测同类组织中淋巴管的数量有明显差别。

3.2 甲状腺切除术中纳米炭甲状旁腺“负显影”的主要机制

近年来，临床实施甲状腺手术时，常应用纳米炭显影技术识别甲状旁腺［9］。纳米炭为纳米级颗粒制成的混悬液，颗粒直径平均为150 nm，由于毛细血管壁的间隙为30～50 nm，而毛细淋巴管为单层内皮细胞构成，呈叠瓦状排列，连接松散，存在的间隙达500 nm，且其基膜发育并不完全，故纳米炭粒不进入血管而迅速进入淋巴管，并滞留集聚于相应淋巴结，使其着色，达到了示踪作用，呈现高度的淋巴系统趋向性。本研究组曾在甲状腺术中应用纳米炭对甲状旁腺保护作用进行系列研究［1，3］，将纳米炭混悬液通过甲状腺淋巴系统扩散，可见甲状腺、甲状腺中央区及侧方淋巴结迅速黑染，而甲状旁腺不被黑染呈“负显影”，可以很好地辨识甲旁腺，考虑其各自为独立的内分泌器官，有独立的淋巴系统，因毛细淋巴管网互不相通而使纳米炭不能流入甲状旁腺使其染色。同期，张筱骅等［4］亦有相同发现，但未深入研究。根据本研究结果，甲状腺实质内具有丰富的淋巴管网，而甲状旁腺组织仅少数存在淋巴管，且一般位于被膜区或脉管区，呈单个或少数局限性分布，由于本研究尚未证实上述甲状旁腺阳性染色的淋巴管是否与甲状腺淋巴管互不相通，本研究认为纳米炭甲状旁腺“负显影”的解剖机制之一，可能是大部分甲状旁腺缺乏淋巴管网，仅小部分旁腺存在少数淋巴管，导致纳米炭在甲状旁腺腺体内引流失败或不畅，而“负显影”甲状旁腺。

表5 近16年甲状旁腺淋巴管研究进展统计表

综上所述，成人大部分甲状旁腺可能缺乏淋巴管网，仅小部分旁腺存在少数淋巴管。这可能是临床上甲状腺术中纳米炭甲状旁腺“负显影”的主要原因之一。关于甲状旁腺淋巴管与临床病理因素的关系，以及甲状旁腺淋巴管与甲状腺淋巴管的交通关系等问题，尚待进一步研究。

致谢：感谢浙江省宁波市医疗中心李惠利医院甲状腺外科吴伟主主任，在本中心前期研究时提供数例病变的甲状旁腺组织标本。

[1] 马云海,钱军,曾玉剑,等.甲状腺癌根治术中应用纳米碳分辨和保护甲状旁腺[J].昆明医学院学报,2011,32(4):68-70.

[2] 白云城,程若川,洪文娟,等.甲状腺淋巴示踪技术对甲状旁腺保护作用的研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2013,48(9):721-725.

[3] 曾玉剑,钱军,程若川,等.甲状腺癌术中淋巴示踪剂应用对于甲状旁腺保护作用的研究[J].重庆医学,2012,41(11):1076-1088.

[4] 张筱骅,郝儒田,尤捷,等.甲状腺淋巴管造影在鉴别甲状旁腺中的意义[J].温州医学院学报,2010,40(01):31-35.

[5]Van der Auwera I,Van den Eynden GG,Colpaert CG,et al.Tumor lymphangiogenesis in inflammatory breast carcinoma:a histomorphometric study[J].Clin Cancer Res,2005,11(21):7637-7642.

[6] 罗文婷,孙大卫.角膜、结膜、脉络膜及视网膜淋巴管和新生淋巴管的研究进展[J].眼科新进展,2013,33(6):584-587.

[7]Jennings RN,Miller MA,Ramos-Vara JA.Comparison of CD34,CD31,and factor VIII-related antigen immunohistochemical expression in feline vascular neoplasms and CD34 expression in feline nonvascular neoplasms[J].Vet Pathol,2012,49(3):532-537.

[8]Nikolic I,Todorovic V,Petrovic A,et al.Immunohistochemical Heterogeneity of the Endothelium of Blood and Lymphatic Vessels in the Developing Human Liver and in Adulthood[J].Cells Tissues Organs,2017,203(4):243-257.

[9]朱精强.甲状腺手术中甲状旁腺保护专家共识[J].中国实用外科杂志,2015,35(7):731-736.

[10]Van der Auwera I,Cao Y,Tille JC,et al.First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours[J].Br J Cancer,2006,95(12):1611-1625.

[11]Pezerovic-Panijan R,Grbesa D,Banek L,et al.The development of blood and lymph vessels of human parathyroid glands in embryonal,fetal and postnatal period[J].Coll Antropol,2001,25(1):333-340.

[12]Pezerovic-Panijan R,Grbesa D,Mederal P,et al.Do parathyroid glands from individuals of different age and gender contain lymph vessels[J]?Coll Antropol,2006,30(2):369-373.

[13]Garcia de la Torre N,Buley I,Wass JA,et al.Angiogenesis and lymphangiogenesis in parathyroid proliferative lesions[J].J Clin Endocrinol Metab,2004,89(6):2890-2896.

[14]Jin ZW,Nakamura T,Yu HC,et al.Fetal anatomy of peripheral lymphatic vessels:a D2-40 immunohistochemical study using an 18-week human fetus(CRL 155 mm)[J].J Anat,2010,216(6):671-682.

[15]Bulun SE,Zeitoun KM,Takayama K,et al.Estrogen biosynthesis in endometriosis:molecular basis and clinical relevance[J].J Mol Endocrinol,2000,25(1):35-42.

[16]Kalof AN,Cooper K.D2-40 immunohistochemistry-so far[J].Adv Anat Pathol,2009,16(1):62-64.