免疫组织化学指标判断非肌层浸润性膀胱癌分期及病理分级的价值

邱柏圣 杜君 张艳辉 王晴 陈薇 王坤 张超 姚欣

膀胱癌在世界恶性肿瘤中位居第9位，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。在美国，每年约有7.4万例患者被诊断为膀胱癌，男、女性膀胱癌发病率分别占男、女性恶性肿瘤发病率的第4位及第11位［1］。在中国，每年约有5.6万例膀胱癌新发病例，2.6万例患者死于该病，发病率呈逐年上升趋势。膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC）。NMIBC分期、病理分级是疾病复发进展的关键预测因子，同时也是指导患者个体化精准治疗的关键。病理学诊断是判断NMIBC分期、病理分级的金标准，但标本质量易受经尿道膀胱肿瘤电切术（transurethral resection of the bladder，TURBT）的影响，如膀胱肿瘤组织被烧灼、电切未能切到膀胱肌层等［2］，而病理学专家判断NMIBC的分期、病理分级中也存在明显的差异［3］。因此迫切需要客观的临床指标以有效地判断NMIBC分期与病理分级。

近年来，随着分子生物学技术的发展，许多与NMIBC相关的免疫组织化学指标逐渐被应用于临床。目前研究证实Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2是肿瘤进展的重要预测指标［4］，但预测其与NMIBC分期及病理分级关系的研究鲜见。本研究旨在通过分析NMIBC患者的临床病理资料及Ki-67、TP53、Cy⁃clin D1、HER-2表达与肿瘤分期、病理分级之间的关系，探究判断NMIBC分期、病理分级的客观指标，为临床诊断及治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2015年1月至2016年12月184例就诊于天津医科大学肿瘤医院行TURBT且术后经病理证实为Ta、T1期NMIBC患者的临床病理资料。患者年龄为26～90岁，平均年龄58岁。患者的肿瘤大小＜3 cm为142例（77.2%），肿瘤大小≥3 cm为42例（22.8%）；肿瘤单发113例（61.4%），肿瘤多发71例（38.6%）；肿瘤初发149例（81.0%），肿瘤复发35例（19.0%）。术后病理G1与G2级102例（55.4%），G3级82例（44.6%）；Ta期125例（67.9%），T1期59例（32.1%）。

1.2 方法

采用免疫组织化学法检测病理组织切片中Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2表达。SP试剂盒、兔抗人Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2单克隆抗体及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，实验步骤严格按照试剂说明进行。采用双盲法，由两位资深病理医师分别阅片。在显微镜下随机选取5个不同视野（×400），每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞的百分比（阳性细胞数/总细胞数×100%）。阳性细胞的百分比大于最佳临界点者定义为高表达，阳性细胞的百分比小于最佳临界点者定义为低表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。采用ROC曲线法确定免疫组织化学各指标的最佳临界值。单因素分析采用χ2检验，多因素分析采用Logistic风险回归模型，计算并比较变量的灵敏度及特异度。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学法检测各指标的表达

利用ROC曲线确定Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2阳性细胞百分比的最佳临界点，分别为25%、75%、45%、70%。Ki-67高表达阳性率为41.8%（77/184），TP53高表达阳性率为27.7%（51/184），Cyclin D1高表达阳性率为84.2%（155/184），HER-2高表达阳性率为22.8%（42/184）。Ki-67、TP53、Cyclin D1、HER-2指标高、低表达的比较见图1。

图1 免疫组织化学法检测各指标的高、低表达（SP法×400）

2.2 患者临床病理特征及免疫组织化学各指标高、低表达与NMIBC分期、病理分级的关系

单因素分析结果显示，肿瘤直径与NMIBC分期、病理分级呈正相关（P＜0.05）；NMIBC的T1期及病理G3级组织中的Ki-67及HER-2高表达，与NMIBC分期、病理分级呈正相关（P＜0.05）；NMIBC的Ta期及病理G1、G2级组织中的Cyclin D1高表达，与NMIBC分期、病理分级呈负相关（P＜0.05，表1）。将单因素有意义的指标纳入Logistic回归模型进行多因素分析，结果显示Ki-67高表达、Cyclin D1低表达为NMIBC的T1期独立预测因素（P＜0.01）；Ki-67高表达、HER-2高表达、Cyclin D1低表达为NMIBC的病理G3级独立预测因素（P＜0.01，表2）。

表1 184例NMIBC患者临床病理特征及免疫组织化学各指标与肿瘤分期、病理分级的关系

表2 患者临床病理特征及免疫组织化学各指标与NMIBC分期、病理分级关系的Logistic多因素分析

2.3 免疫组织化学法检测各指标的灵敏度与特异度

免疫组织化学指标Ki-67预测NMIBC分期和病理分级的灵敏度和特异度较Cyclin D1、HER-2高（表3）。

表3 免疫组织化学指标预测NMIBC分期、病理分级的灵敏度与特异度

3 讨论

膀胱癌是最常见的泌尿生殖系统肿瘤，首诊患者中约75%被诊断为NMIBC，超过50%NMIBC患者术后2年复发，45%患者进展为MIBC。Holmäng等［5］研究应用欧洲泌尿外科协会指南推荐的EORTC危险评分系统，对NMIBC患者复发进展风险进行评估，其中病理分级按照世界卫生组织（WHO）分级法（1973年）将患者分为低危组、中危组、高危组，精确地制定出治疗方案，而NMIBC的T分期、病理分级是EORTC危险评分系统的两个关键分层指标。研究发现，NMIBC分期、病理分级的一致率仅为50%～60%［6-7］。近年来，膀胱癌的很多分子标志物逐渐被应用于临床，如果可应用这些客观的指标协助判断NMIBC分期、病理分级，则可以帮助临床医生制定下一步治疗方案，从而改善患者预后，避免治疗不足或过度治疗。

Ki-67是一种大分子增殖细胞核蛋白，除G0期外在细胞周期各个阶段均表达，能反映乳腺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤的细胞增殖活性。Wang等［8］研究了270例NMIBC患者临床病理特征及免疫组织化学指标发现，Ki-67增殖活性与NMIBC患者分期、病理分级呈正相关。此外，Otto等［9］研究结果表明，膀胱癌患者组织中的Ki-67高表达具有较差的无复发生存率（recurrence free survival，RFS）、无进展生存率（progression free survival，PFS）和肿瘤特异性生存率（cancer specific survival，CSS）。对膀胱癌T1期病理G3级的亚组分析结果显示，Ki-67高表达是预测NMIBC进展、复发的独立预测因子［10］。本研究发现Ki-67高表达是NMIBC的T1期和病理G3级的独立预测因素，与上述研究结果基本一致，并且免疫组织化学指标Ki-67在预测NMIBC分期和病理分级中有较高的灵敏度和特异度，因此可应用该指标协助临床医生判断NMIBC分期与病理分级。

HER-2是跨膜酪氨酸激酶受体家族成员之一，HER-2基因扩增与乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌多种恶性肿瘤细胞的生长、侵袭、转移及不良预后密切相关。有研究证实，膀胱癌组织中的HER-2高表达患者的分期和病理分级均较高，预后较差［11］，但也有研究并未发现其相关性［12］。因此，HER-2基因扩增和蛋白高表达在膀胱癌中的意义并不十分明确。本研究结果发现HER-2高表达与NMIBC分期、病理分级相关，是NMIBC病理G3级独立预测因素。一项Meta分析结果显示，HER-2基因扩增与膀胱癌高分级、伴有淋巴结转移相关，其PFS和无病生存率（disease free survival，DFS）均较低［11］。Chen等［13］研究发现HER-2基因扩增与NMIBC病理G3级相关，与本研究结果相似。免疫组织化学检测指标HER-2预测NMIBC分期、病理分级的灵敏度与特异度较Ki-67低。

Cyclin D1是一种常见的细胞周期调节因子。在正常细胞周期中，Cyclin D1与CDK4、CDK6形成复合物，使Rb蛋白磷酸化而失活，从而使细胞周期从G1期进入S期，完成细胞增殖［14］。Cyclin D1高表达能缩短G1期，促使细胞提前进入S期，引起细胞生长失控、转化和癌变。El-Gendi等［15］分析了 100 例行TURBT的膀胱癌患者的临床病理特征与免疫组织化学指标的相关性，研究结果显示Cyclin D1表达与膀胱癌分期（NMIBCvs.MIBC）、病理分级（lowvs.high）均无明显相关性。本研究结果显示，NMIBC的Ta期及病理G1、G2级组织中的Cyclin D1高表达，与肿瘤分期及病理分级呈负相关；Cyclin D1低表达是NMIBC患者T1期及病理G3级的独立预测因素。各研究结果差异的原因，可能由于研究机构采用免疫组织化学染色方法存在差异，以及选取的cut off值未能统一所导致。但免疫组织化学指标Cyclin D1预测NMIBC分期及病理分级的灵敏度与特异度也较Ki-67低。

综上所述，本研究选取的免疫组织化学指标Ki-67的表达水平与NMIBC分期、病理分级呈正相关，是判断NMIBC分期、病理分级的独立预测因素，由于其敏感性及特异性较高、操作方便，对NMIBC分期、病理分级判断较困难的患者具有鉴别意义，适用于临床应用。但本研究属于回顾性分析，在患者选择上可能存在偏倚，样本量较少且为单中心研究，尚需更大样本量的验证。

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