醋酸钠及复配4种矿物质对草菇菌丝生物量的影响

侯立娟，林金盛，刘少华，李瑞祥，马 林，蒋 宁，曲绍轩，李辉平

(1.江苏省农业科学院 蔬菜研究所，江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014；2.鲁东大学 农学院，山东 烟台 264025)

草菇(Volvariellavolvacea)又名中国蘑菇[1]，不仅味道鲜美，营养丰富，还具有抗肿瘤，提高免疫力的作用，是一种食用兼药用的名贵食用菌[2]，以草菇为原料开发的产品备受青睐[3]。草菇是典型的高温型食用菌，其产量位居食用菌行业第8位，具有很高的经济价值[4]。与其他食用菌相比，草菇的生长周期较短，从营养生长到生殖生长形成子实体，这一周期仅需14～18 d。草菇菌丝生长的快慢及菌丝的生物量的积累对草菇子实体形成和生长有着重要影响。目前，关于草菇液体培养的研究多集中在生长因子[5-7]，而对如何增加草菇菌丝生物量的研究相对较少。生物量是关系到草菇产量的一个关键因素，据报道，在麦芽膏培养基中添加醋酸盐可以促进双孢蘑菇菌丝结实[8]，考虑双孢蘑菇和草菇同属草腐菌，此方法可以借鉴，研究不同浓度对草菇生物量的影响，结合报道的适宜浓度的矿质元素具有促进提高金针菇[9]、灰树花[10]、荷叶离褶伞[11]、灵芝[12]等食用菌菌丝生物量的作用。本研究通过设置不同浓度梯度的醋酸钠及复配4种矿质元素对草菇菌丝生物量的影响试验分析，以期为工厂化生产高质量草菇液体菌种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌种草菇V23由上海农业科学院食用菌研究所提供。

1.2 供试培养基

PDA培养基：土豆200 g(煮汁)，葡萄糖20 g，琼脂20 g，定容至1 L。

市售CPDB培养基：24 g定容至1 L。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的活化

草菇V23菌株斜面活化后，接种于PDA平皿上，32 ℃培养5 d，待菌丝长满平板后即可用来接种。

1.3.2 不同浓度醋酸钠液体培养试验

将醋酸钠作为生长调节剂，设计单因素实验，筛选出最适醋酸钠浓度。再分别采用液体培养的方法测定其菌丝的生物量并提取DNA确定其生物量。

先将醋酸钠配制成母液，在市售CPDB培养基中分别加入0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 g·L-1的醋酸钠，共6个处理，分装于250 mL锥形瓶内，每瓶装100 mL，每个处理6个重复。然后取活化后的V23草菇菌种置9 cm的平板，挖去接种点为中心向外辐射1 cm区域于均质仪中，加入100 mL无菌水，打碎10 s，取1 mL菌种接入含100 mL PDB的250 mL三角瓶中，120 r·min-1，32 ℃培养5 d。

1.3.3 添加不同浓度醋酸钠的菌丝生物量定量评价指标DNA提取及含量测定

将3瓶菌丝收获后分别放在-50 ℃冻干燥机中充分干燥，用于提取DNA。经冻干的各处理的菌丝迅速研磨，各处理用精确秤取菌丝20 mg，分别装于2 mL离心管中，采用生工Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，每个处理设置3次重复。用紫外分光光度计测定提取的DNA浓度，并确定其含量，其DNA含量作为生物量评价的定量指标。各个浓度梯度的样品分别称取2、4、6、8、10 mg测定DNA浓度，绘制标准曲线，然后算出各个浓度梯度DNA的质量。各处理的标准曲线分别如下：

对照(CK)的标准曲线为y=72.084x+140.16，R2=0.996 8；

0.1 g·L-1的标准曲线为y=48.543x+9.4967，R2=0.997 4；

0.3 g·L-1的标准曲线为y=29.915x+36.363，R2=0.999 0；

0.5 g·L-1的标准曲线为y=18.85x+73.867，R2=0.997 3；

0.7 g·L-1的标准曲线为y=15.338x-0.4433，R2=0.990 8；

0.9 g·L-1的标准曲线为y=18.27x-10.447，R2=0.993 7；

1.1 g·L-1的标准曲线为y=12.485x+59.503，R2=0.991 1。

1.3.4 醋酸钠复配4种微量元素对草菇菌丝生物量的影响

选择4种微量元素(Zn、Cu、K、Mn)，设置不同的浓度梯度如下：ZnSO4(0.10、0.15、0.20、0.25 g·L-1)，KH2PO4(3、4、5、6、7、8 g·L-1)，MnSO4(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g·L-1)，CuSO4(0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g·L-1)，在最适醋酸钠浓度为0.7 g·L-1的基础上筛选醋酸钠复配不同浓度梯度的微量元素，来比较对草菇菌丝生物量的影响。不同微量元素添加到草菇液体培养基中的操作方法参考1.3.2节，醋酸钠复配4种微量元素浓度的生物量采用测定其DNA含量来评价，具体方法参考1.3.3节。

1.4 数据处理

采用Excel 2007软件进行数据处理，利用DPS统计分析软件对数据进行显著分析处理，大写字母代表显著水平P<0.01，小写字母代表显著水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同浓度醋酸钠对草菇菌丝生物量的影响

不同浓度的醋酸钠对草菇菌丝生物量的影响以液体培养5 d后的菌丝定量提取DNA含量为评价指标，结果显示，随着醋酸钠含量的增加，其菌丝的DNA含量呈线性增加，当增加到一个最高点，即醋酸钠含量添加为0.7 g·L-1时，菌丝所含有的DNA含量最高，分别比CK、0.1 g·L-1、0.3 g·L-1、0.5 g·L-1处理增加51.62%、23.41%、19.66%、10.24%，随着醋酸钠含量达到0.9 g·L-1、1.1 g·L-1时，DNA含量逐渐下降，虽然分别比0.7 g·L-1处理减少19.45%和21.06%，但是也分别比CK的DNA含量高22.12%和19.66%。由此说明采用醋酸钠处理后，菌丝DNA含量的影响是随着醋酸钠含量的增加呈线性增加，当达到最高值后，又呈减少趋势，各处理的DNA含量极显著高于CK。说明适量添加醋酸钠能够促进菌丝的生物量的增加。

2.2 醋酸钠复配4种微量元素对草菇菌丝生物量的影响

2.2.1 醋酸钠复配不同浓度的CuSO4对草菇菌丝生物量的影响

在筛选出适宜的醋酸钠浓度为0.7 g·L-1的基础上，复配CuSO4的不同浓度对菌丝生物量的影响见图1- A。实验结果表明，随着CuSO4浓度的增加，对菌丝的DNA 含量影响呈现先增加后降低的趋势，当CuSO4浓度增加到0.04 g·L-1时，其菌丝DNA含量最高，之后，再随着CuSO4浓度的增加，菌丝DNA 含量反而呈减少趋势。与CK比，添加0.04 g·L-1的CuSO4时，草菇菌丝生物量达到显著水平(P<0.05)，其DNA浓度为871.43 μg·mg-1，比CK(DNA为503.16 μg·mg-1)增加368.27 μg·mg-1，提高73.19%；添加CuSO4的浓度分别为0.06 g·L-1、0.08 g·L-1时，菌丝DNA 含量比CK提高16.47%和31.47%；浓度为0.1 g·L-1和0.12 g·L-1的CuSO4其菌丝的DNA含量减少8.85%和30.19%，但CK与添加CuSO4浓度为0.06 g·L-1、0.08 g·L-1、0.10 g·L-1和0.12 g·L-1处理之间菌丝生物量不存在显著性差异。

表1不同浓度醋酸钠处理对草菇菌丝DNA含量的影响

Table1Effect of different concentrations of sodium acetate on mycelium DNA content ofV.volvacea

处理Treatment/(g·L-1)菌丝DNA含量/(μg·g-1)MyceliumDNAcontent/(μg·g-1)显著性分析Significantanalysis(P<0.01)02.39±0.10G0.17.48±0.29F0.311.46±0.21E0.518.32±0.89D0.731.42±0.83A0.921.46±0.21C1.125.31±0.44B

不同处理间没有相同大写或小写字母表示差异极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)。The bars with different uppercase or lowercase letters showed the significance at the level of 0.05 or 0.01.图1 不同浓度的微量元素对草菇菌丝DNA含量的影响Fig.1 Effect of different concentrations of microelements on mycelium DNA content

2.2.2 醋酸钠复配不同浓度的KH2PO4对草菇菌丝生物量的影响

复配不同浓度KH2PO4试验结果见图1- B。与CK比，各处理均能提高菌丝DNA 含量，其中，当KH2PO4达8.0 g·L-1时对草菇菌丝的生长影响最好，其DNA 含量(927.47 μg·mg-1)高于其他各处理，比对照(DNA含量503.16 μg·mg-1)显著提高84.32%(P<0.05)；浓度为5.0 g·L-1的KH2PO4对草菇菌丝的生长影响次之，比对照增加70.98%；除CK 外，其他各处理之间的DNA含量无显著差异。浓度为4.0 g·L-1和6.0 g·L-1的KH2PO4对草菇菌丝的生物量的影响不大。

2.2.3 醋酸钠复配不同浓度的MnSO4对草菇菌丝生物量的影响

复配不同浓度的MnSO4对草菇菌丝的生长影响见图1- C。不同浓度MnSO4对菌丝生长的影响不同。当MnSO4浓度为0.35 g·L-1时，菌丝的生物量最大，当MnSO4浓度为0.20 g·L-1时，菌丝的生物量最小，并极显著高于浓度为0.20 g·L-1(P<0.01)，虽然0.35 g·L-1的MnSO4(630.07 μg·mg-1)，比对照CK(503.16μg·mg-1)提高25.22%；浓度为0.20 g·L-1的MnSO4(218.47 μg·mg-1)比CK减少56.58%，MnSO4的各处理之间与CK相比，不存在差异显著性。

2.2.4 醋酸钠复配不同浓度的ZnSO4对草菇菌丝生物量的影响

醋酸钠复配添加ZnSO4对菌丝生物量的影响(图1- D)表明，适宜的ZnSO4浓度能显著促进草菇菌丝的生物量，按照对菌丝生物量的影响从高到低，ZnSO4的添加量依次为：0.25 g·L-1>0.20 g·L-1>CK>0.10 g·L-1>L 0.15 g·L-1。浓度为0.25 g·L-1的ZnSO4对草菇菌丝的生物量积累最大，其DNA含量为718 μg·mg-1，比CK的(DNA含量503.16 μg·mg-1)提高42.69%；浓度为0.20 g·L-1的ZnSO4对草菇菌丝的生长影响次之，比对照CK的DNA含量提高20.34%；ZnSO4添加量为0.25 g·L-1与0.15 g·L-1之间的菌丝生物量达到1%极显著水平；0.25 g·L-1和0.10 g·L-1达到5%显著水平，0.25 g·L-1、0.20 g·L-1与CK 之间不存在显著差异。

3 讨论

本实验在液体培养条件、接种条件一致的情况下，研究醋酸钠在不同梯度浓度下液体培养对草菇菌丝生物量的影响，借鉴余昌霞等[13-14]报道的DNA含量为指标检测液体培养中相对生物量的方法。根据前者的研究报道，同等液体培养条件下的菌丝生物量和单位干重菌丝中DNA含量均受到培养基质细微变化的影响[13]。因此，液体培养参考余昌霞等[13]研究所用的市售的CPDB培养基，成分稳定；DNA含量测定是定量秤取每个处理研磨好的菌丝粉末，使人为误差降到最低。从测定对菌丝DNA含量作为生物量的影响指标看，醋酸钠添加后都极显著地提高了菌丝生物量，对菌丝生物量影响的趋势表现为，生物量随着醋酸钠浓度的增加呈线性增加的趋势，当达到0.7 g·L-1时，生物量达到一个高峰值，测得菌丝的DNA含量为468.9±4.10 μg·g-1，极显著地高于CK，当醋酸钠浓度继续增加为0.9 g·L-1和1.1 g·L-1，测得生物量均呈减少的趋势，但仍比CK的生物量高。说明醋酸钠添加后能极显著地增加草菇的生物量的稳定性。为了使菌丝的生物量最大化，进一步在筛选出最适醋酸钠浓度(0.7 g·L-1)基础上复配Cu、Zn、K、Mn元素，以添加醋酸钠为对照，进一步筛选对草菇菌丝生长有促进作用的适宜矿物质元素和最佳浓度，实验结果显示，复配矿物质元素适宜浓度对草菇菌丝生物量有促进作用，浓度过高或者过低反而抑制草菇菌丝的生长。其中，添加矿物质K元素和Cu元素效果较好，各浓度均能比CK菌丝的生物量有所增加，其中添加KH2PO4为8 g·L-1比CK加菌丝的生物量增加84.32%，达到5%显著水平；CuSO4为0.04 g·L-1时比CK的菌丝生物量增加了73.19%，达到5%显著水平。已报道适量的铜可以促进多种食用菌菌丝体的生长，例如，在平菇[15-16]、金针菇[17]、亚侧耳[18]、大球盖菇[19]、杏鲍菇[20，21]、白灵菇[22]、松茸[23]中发现，适量的铜可以使菌丝生长加快，菌丝粗壮、洁白，提前成熟，产量和生物学效率提高，这些结果与本研究的试验结果相似，说明适量的Cu元素可以促进菌丝的生长和菌丝体生物量的显著增加。据卢娇娇[24]报道，白灵菇的PDA 平板培养基中添加不同铜浓度，100～250 μmol·L-1能促进平菇菌丝生长，菌丝洁白、长势旺、菌落边缘整齐；1 000 μmol·L-1时，能显著抑制平菇菌丝生长，且菌丝稀疏，朝一边生长；液体培养基中添加 250～500 μmol·L-1铜能增加菌丝干质量，1 000 μmol·L-1的铜时，能明显降低平菇菌丝干质量。结果说明即使是同一品种的食用菌添加量不同，Cu元素对固体培养条件下菌丝生长的影响和液体培养条件下菌丝干质量的影响也是不同的。同时，Cu元素对食用菌生长发育的影响，也存在种类差异。谢必峰等[25]报道了 Cu 元素对香菇产量存在明显的抑制作用，而对凤尾菇却有增产效应。Beelman等[26]研究表明Cu的积累可以增加双孢蘑菇的产量和质量。

在添加1 g·L-1KH2PO4时，杏鲍菇菌丝生长的促进作用最明显，与对照差异显著[27]。龚凤萍[28]报道，在培养基中添加一定浓度的钾，能促进平菇菌丝生长，菌丝浓白、菌落边缘整齐；在液体培养基中添加的钾，平菇菌丝生物量明显提高；在棉籽壳中添加的钾，平菇菌丝长速变化不大，但菌丝长势变好，栽培生物学效率提高。磷酸二氢钾对杨树菇菌丝体生长有明显的促进作用， 培养基含有磷酸二氢钾时的菌丝最高生长量要比不含磷酸二氢钾的高出0.122 g·100 m-1[29]。在磷酸二氢钾(KH2PO4)对香菇生长量影响的试验中，在液体养条件下，KH2PO4浓度为0.05%， 发酵96 h，香菇生长量最大[30]，与本实验的研究结果相同。

据报道，Zn是金针菇生长的必需元素，在4 mg·kg-1以内明显促进金针菇菌丝生长，超过5 mg·kg-1生长量下降，到6 mg·kg-1时表现出对金针菇菌丝体的抑制效果[31]，鸡腿菇栽培种，培养基中添加400 mg·L-1的Zn，能促进菌丝体的生长[32]。硫酸锌、硫酸铜分别为3 mg·kg-1，200 mg·kg-1时，能促进香菇菌丝的生长[33]。张长青等[34]认为，在添加后，白灵侧耳菌丝萌发早，菌丝生长快，且较浓密健壮。本实验的结果显示，适当浓度的MnSO4和ZnSO4对菌丝生物量有促进作用，但与CK相比无显著差异。主要原因分析，一是可能由于栽培品种的差异，对铜元素吸收利用能力不同；二是由于设置的浓度梯度不同造成的。

建立定量指标来衡量菌丝生长发育的情况，揭示生长现象与其生理代谢的关系成为学者关注热点[35-40]。本实验从单一变量研究醋酸钠不同梯度浓度对草菇菌丝生长的影响，有助于了解有关添加醋酸钠能增加草菇生物量的原因，其原因可能是添加醋酸钠后，使培养基质的pH值更有利于草菇菌丝的生长，草菇生长喜欢碱性条件；也有可能是添加醋酸钠后补充了微量元素，或提供了能量物质或营养物质供草菇菌丝生长利用，其促进生物量的作用机理有待于进一步研究证明。本研究结果可以为工厂化草菇液体菌种生产提供参考。

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