乌鳢(Channa argus)源摩氏摩根菌(Morganella morganii)的分离、鉴定及药敏特性

杨移斌，宋 怿，杨秋红，刘永涛，杨先乐，艾晓辉，*

(1.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430223； 2.农业部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141； 3.上海海洋大学，上海 201306)

乌鳢(Channaargus)又名才鱼、墨鱼、乌鱼、孝鱼、生鱼、蛇头鱼等，其分类地位为鲈形目(Perciformes)鳢科(Channidae)鳢属(Channa)[1]。乌鳢是凶猛的肉食性经济鱼类，适应能力强，对各种不良环境具备较强耐受力，在我国分布区域广泛，天然环境下生长的乌鳢很少发病[2]。乌鳢肉质鲜美、营养丰富，而且具备去瘀生新、健脾利水、生肌补血及滋补调养等医疗功效[3]，因此获得广大消费者的喜爱，市场需求逐步扩大。为了满足市场需求，乌鳢人工养殖产量不断提升，但因其养殖规模不断扩大，集约化程度不断提高，养殖环境日益恶化，导致病害频发。目前，乌鳢养殖过程中主要疾病包括结节病[2，4-5]、溃烂病[6-7]、腹水病[8]、腐皮病[9]、出血病[10]等，这些病害的暴发，给养殖户带来了较大的经济损失，也严重制约了乌鳢养殖业健康可持续发展。

2016年5—6月江西南昌某养殖场暴发慢性传染疾病，导致乌鳢批量死亡，死亡乌鳢主要症状为：乌鳢头部及尾部有严重大块溃烂，肛门红肿外翻；解剖后发现肾、脾等充血，脾脏严重肿大，肝脏较脆易碎，颜色发黄，肠道发白，内无食物。发病期持续近1个月，累计死亡率达20%，死亡鱼体质量大多为1.0～1.5 kg，造成较大经济损失。本研究从患病濒死乌鳢体内分离到一株优势菌，对其开展人工感染试验、生理生化特性测定、16S rRNA序列分析及药物敏感性等试验，以期为乌鳢在养殖过程中暴发的细菌性疾病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试鱼

发病乌鳢(1.0～1.5 kg)10尾采于江西南昌某乌鳢养殖场；健康乌鳢苗(50±2) g购自武汉某乌鳢繁殖场，乌鳢苗活力强、无伤病，暂养7 d无异常后用于试验。

1.1.2 主要试剂

MH琼脂、营养琼脂、营养肉汤、革兰氏染色液、药敏纸片及细菌微量生化管均购自杭州微生物试剂有限公司；PCR反应体系、细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；测序服务及引物合成均由武汉擎科生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离

取具有典型病症，如体表溃烂及重要组织器官充血等(图1)的乌鳢10尾，经75%乙醇消毒后，在无菌操作台内取病鱼肝肾脾、溃烂处肌肉，接种于普通营养琼脂平板上，置于28 ℃恒温培养箱中18～24 h，挑取形态大小、颜色一致，以及优势度高的菌落进行细菌再纯化，将分离纯化得到的菌株与15%甘油混匀后保存于-80 ℃冰箱，分离菌株暂命名为JX15。

图1 发病乌鳢Fig.1 Diseased Channa argus

1.2.2 人工感染及半致死剂量LD50测定

将JX15株划线于普通营养琼脂平板上，恒温培养18 h后，用无菌生理盐水洗下菌苔，并参照麦氏比浊法调整菌悬液浓度为4.9×109cfu·mL-1。

将健康乌鳢分为试验组及对照组，每组均设置3个重复，每个重复30尾乌鳢。试验期间连续充氧，水温控制在22～25 ℃。试验组乌鳢腹腔注射JX15株菌悬液0.1 mL·尾-1，对照组相同部位注射等量无菌生理盐水。定时观察乌鳢游动状况，及时记录发病死亡乌鳢数量及症状，并进行细菌再分离。

将分离菌株JX15用无菌生理盐水稀释成浓度为3.0×1010、3.0×109、3.0×108、3.0×107、3.0×106cfu·mL-1的菌悬液，分别注射到不同组的乌鳢体内，注射量为0.1 mL·尾-1，即不同组每尾乌鳢注射JX15株的剂量分别为3.0×109、3.0×108、3.0×107、3.0×106、3.0×105cfu，而对照组相同部位注射等剂量无菌生理盐水，每组乌鳢30尾。连续查看乌鳢游泳状况，及时记录发病死亡量，并用概率单位图解法[11]计算半致死剂量(LD50)。

1.2.3 形态学及生理生化特性测定

将JX15菌株接种于普通营养琼脂平板上，置于28 ℃恒温培养中培养24 h后，观察菌落大小、形态特征及其颜色，并进行革兰氏染色及镜检。菌株JX15的理化特性采用细菌生化微量鉴定管[12]进行测定。

1.2.4 JX15株16S rRNA与gyrB基因测序

模板制备。将JX15株接种于普通营养肉汤中，置于摇床(200 r·min-1)恒温28 ℃培养18 h，将JX15菌液离心后收集菌体，提取DNA作为PCR模板。

16S rRNA测序。上游引物为27F，5′- AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG- 3′，下游引物为1492R，5′- GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′。参照赖晓健等[13]方法进行PCR反应扩增目的基因。PCR反应产物送武汉擎科进行纯化及序列测定。

gyrB测序。引物参照Yamamoto等[14]设计：UP1，5′- GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA- 3′；UP2，5′- AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT- 3′。PCR 反应条件参照文献[15]，PCR反应产物送武汉擎科生物技术有限公司进行纯化及测序。

系统发育分析。将分离纯化菌株的16S rRNA及gryB基因与NCBI中已经存储的基因序列进行Blast比对，根据Blast比对结果，选取同源性较高的序列采用Clustal X软件进行多序列匹配分析，通过MEGA 5.1软件Neighbor- Joining法构建系统进化树，1 000次Bootstrap检验置信度。

1.2.5 药敏特性分析

JX15株的药敏特性研究参照NCCLS抗微生物药物敏感性试验执行标准，采用纸片扩散法[16]。将JX15株接种于普通营养肉汤中，置于摇床(200 r·min-1)28 ℃恒温培养18 h，用无菌生理盐水稀释成浓度为1.5×107cfu·mL-1的菌悬液，取150 μL菌液均匀涂于水解酪蛋白琼脂平板上，贴上药敏纸片，置于28 ℃恒温培养24 h后测量药敏纸片的抑菌圈直径。根据药敏纸片厂家提供的抑菌圈直径判断标准进行判断。

1.2.6 组织病理损伤观察

取具有典型症状的乌鳢溃烂皮肤肌肉、肝脏、肾脏、脾脏及肠道，用10%的中性缓冲福尔马林固定液固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片(厚度4 μm)，苏木精- 伊红(HE)染色，中性树脂胶封片后，显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 细菌分离和LD50测定

从自然发病濒死乌鳢肝肾脾、肌肉溃烂处分离到同一株优势菌JX15。经人工感染试验，试验组乌鳢出现死亡，15 d内累计死亡达90%，而对照组试验鱼未出现任何异常。感染致死乌鳢出现体表轻微溃烂，肛门红肿，有血水从肛门流出，肝、肾、脾严重充血等症状，与自然发病症状基本一致，并从感染死亡乌鳢体内再分离到与菌株JX15一致的菌株，表明JX15株是乌鳢此次溃烂病的病原菌。建立试验鱼死亡率(%)与细菌剂量对数[lg(cfu)]的关系曲线：y=24x-123.52(图2)，JX15株对乌鳢半数致死剂量LD50=3.4×105cfu·g-1。

2.2 细菌鉴定

JX15株在普通营养琼脂上28 ℃恒温培养24 h后出现大小为0.7～1.2 mm圆形、边缘无缺刻、中央凸起、灰白色、表面光滑的菌落。镜检可见分离菌株JX15为革兰氏阴性短杆菌。其理化特性见表1，由理化特性初步确定分离菌株JX15是摩氏摩根菌。将JX15的16S rRNA及gyrB基因序列与NCBI中存储的序列进行Blast比对，结果显示JX15株与摩氏摩根菌同源性最高，为99%。选取同源性较高的摩根菌属序列及水产常见病原菌的16S rRNA及gyrB基因序列构建系株是摩氏摩根菌(Morganellamorganii)。

图2 乌鳢死亡率(%)与细菌剂量对数 [lg(cfu)]的关系曲线Fig.2 Relation curve of Channa argus mortality with logarithm of bacterial dose

统发育树(图3、4)，结果显示，JX15株与摩氏摩根菌聚为一簇。结合理化特性测定结果判定JX15

表1菌株JX15生理生化特征

Table1Physiologic and biochemical characteristics of strain JX15

试验项目TestitemJX15M.morganii[12]试验项目TestitemJX15M.morganii[12]运动性Motility++V-P--精氨酸双水解酶Argininedihydrolase--乳糖Lactose--脲酶Urease++鼠李糖Rhamnose--柠檬酸盐Citrate++蔗糖Sucrose--七叶苷Aesculin--木糖Xylose--H2S--阿拉伯糖Arabinose--明胶Gelatin--麦芽糖Maltose--氧化酶Oxidase--棉子糖Raffinose--硝酸盐还原Nitratereductic++丙二酸盐Malonicacidsalt--鸟氨酸脱羧酶Ornithinedecarboxylase++接触酶Catalase++赖氨酸脱羧酶Lysinedecarboxylase--粘菌素Colistin++

+，阳性Positive；-，阴性Negative。

图3 JX15株根据16S rDNA 基因序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of JX15 strain based on 16S rDNA gene sequence

图4 JX15株根据gyrB 基因序列构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of JX15 strain based on gyrB gene sequence

2.3 药敏特性

药敏特性结果显示：JX15株对氟苯尼考、诺氟沙星及头孢噻肟等7种药物高度敏感；对呋喃唑酮、氯霉素及卡那霉素等4种药物中度敏感；对环丙沙星、苯唑西林及青霉素等11种药物耐药。具体见表2。

2.4 组织病理观察

发病乌鳢溃烂处肌肉肿瘤细胞呈囊状排列，肿瘤细胞大小均一，胞核异型性小，如图5- A淡灰色箭头所示；囊状排列的肿瘤细胞之间充满结缔组织，如图5- A灰色箭头所示；组织中部分肌纤维萎缩，如图5- A黑色箭头所示。肝细胞胞质广泛呈空泡状，如图5- B淡灰色箭头所示；部分肝窦轻度瘀血，如图5- B灰色箭头所示。脾脏白髓中血管扩张，充满棕黄色颗粒物，如图5- C黑色箭头所示；组织中淋巴细胞数量丰富，红白髓界限清晰，未见其他明显异常，如图5- C灰色箭头所示。肠道组织中可见嗜碱性黏液，如图5- D黑色箭头所示；肠上皮局部杯状细胞增生，如图5- D淡灰色箭头所示。肾脏组织中可见片状出血灶，如图5- E黑色箭头所示；伴炎性细胞浸润，如图5- E灰色箭头所示；部分肾小管上皮细胞肿胀，胞质中可见空泡，如图5- E淡灰色箭头所示。

表2JX15株药敏试验结果

Table2Antibiotic sensitivity of strain JX15

药物Drug抑菌圈直径判断标准Judgmentstandardofinhibitionzonediameter/mm耐药Resistant中度敏感Mediumsensitivity高度敏感Highlysensitive药物含量Dose/(μg·disc-1)抑菌圈直径Inhibitionzonediameter/mm敏感性Sensitivity环丙沙星Ciflox≤15>15～21≥2150R苯唑西林Oxacillin≤10>10～13≥1310R青霉素Penicillin≤19>19～28≥2810U0R头孢拉定Cefradine≤14>14～18≥18300R阿莫西林Amoxicillin≤13>13～18≥18200R呋喃唑酮Furazolidone≤14>14～17≥1730016I磺胺异噁唑Sulfisoxazole≤12>12～17≥173000R氯霉素Chloramphenicol≤12>12～18≥1830014I氟苯尼考Florfenicol≤12>12～18≥187522S克林霉素Clindamycin≤14>14～21≥2120R利福平Rifampicin≤16>16～20≥2050R诺氟沙星Norfloxacin≤12>12～17≥171026S头孢噻肟Cefotaxime≤14>14～23≥233025S红霉素Erythromycin≤13>13～23≥231512R新霉素Neomycin≤12>12～17≥173023S卡那霉素Kanamycin≤13>13～18≥183016I多西环素Doxycycline≤12>12～16≥163010R左氧氟沙星Levofloxacin≤13>12～17≥1750R链霉素Streptomycin≤11>12～15≥151014I妥布霉素Tobramycin≤12>12～15≥151020S庆大霉素Gentamicin≤12>12～15≥151019S阿米卡星Amikacin≤14>14～17≥173021S

S， 高度敏感； I，中度敏感；R， 耐药。

S， Highly sensitive; I， Medium sensitivity; R， Resistant.

A，溃烂肌肉；B，肝脏；C，脾脏；D，肠道；E，肾脏。A， Ulcerated muscle; B， Liver; C， Spleen; D， Intestines; E， Kidney.图5 肌肉和内脏组织病理切片图Fig.5 Pathological section of muscle and viscus tissues

3 讨论

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)又称摩根氏菌，1906年被Morgan首次发现，其隶属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)摩根菌属(Morganella)。摩氏摩根菌在自然界分布广泛，在水体、土壤及空气中均有分布，但却是可引起严重感染的条件致病菌之一。摩氏摩根菌毒力较强，能引起包括人在内的多种动物死亡。感染致病症状主要有皮肤溃烂、肌肉出血、重要组织器官出血充血及肠道坏死等。目前已经证实摩氏摩根菌可以引起人类多种感染性疾病，如败血症、关节炎及肺炎等[17-19]，是继发感染重要病原菌，危害较大。同时研究者也从患肺炎袋鼠[20]、海狸鼠[21]、蛇[22]、病鸡[23]，甚至鸡蛋[24]中分离到摩氏摩根菌，表明摩氏摩根菌对陆生动物同样具有很严重的危害，可能会通过垂直传播途径进一步扩散，更进一步影响食品安全，危害人类健康。摩氏摩根菌导致水生动物致病的报道更多，黎小正等[25]及兰云等[26]均报道了黄喉拟水龟感染摩氏摩根菌死亡病例；陈永亮等[27]及孔蕾等[28]分别报道了摩氏摩根菌导致中华鳖肠道坏死病及类似疖疮样病症；李瑞伟等[29]及李雪峰等[30]研究发现，摩氏摩根菌能引起大鲵及鲈鱼体表出血；韩娜娜等[31]及王磊等[32]分别报道了摩氏摩根菌引发锦鲤及黑格尔七彩神仙鱼体表溃烂等。本研究从患病乌鳢体内分离到同一株优势菌JX15，经回归感染及鉴定，确定摩氏摩根菌为此次乌鳢发病的病原菌，对乌鳢的LD50为3.4×105cfu·g-1，显示了较强毒力。关于摩氏摩根菌引起乌鳢致病报道尚属首次。综上可以得出，摩氏摩根菌致病对象范围进一步扩大，危害性进一步增强，但其致病机制尚未完全明晰，因此深入研究摩氏摩根菌变得更加迫切。

随着现代分子生物技术发展，分子生物手段在细菌鉴定中发挥的作用越来越大。16S rRNA是一个高度保守的基因序列，但在不同种属间又具备一定的变异，因此可以很好地将细菌鉴定到属甚至种，目前已经成为细菌鉴定的重要工具[33]。但由于16S rRNA 基因序列在种内鉴定有一定的局限性，为此，常在测完16S rRNA基因后再次测定进化相对较快的gryB等基因序列[34]，以使鉴定更加精准。本研究通过测定分离菌株JX15的16S rRNA及gyrB基因序列，分别构建了系统发育树，在进化树上都可以明显看到分离菌株JX15与摩氏摩根菌聚为一支，因此综合理化特性可以准确判定分离菌株为摩氏摩根菌。

目前，水生动物细菌性病害防控仍然主要依靠药物手段，但近年来，水生动物病原菌的耐药性不断增强，使得病害防控变得更加困难。摩氏摩根菌极易产生耐药性，研究表明，其对氨基糖苷类、氯霉素类、β- 内酰胺类都产生过耐药[28]。本研究发现JX15株对氟苯尼考、诺氟沙星及头孢噻肟等7种药物高度敏感，对呋喃唑酮、氯霉素及卡那霉素等4种药物中度敏感，对环丙沙星、苯唑西林及青霉素等11种药物耐药。其中对氟苯尼考等高度敏感与陈永亮等[27]研究一致。本研究结果可为乌鳢摩氏摩根菌病防控提供参考。

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