不同处理对苹果抗氧化活性的影响

蒋萍，黄业传，王艳蓉，宋琳琳

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010）

我国苹果资源丰富，年产量约3 500万吨[1]。苹果富含多酚、黄酮等多种生物活性物质，具有提高记忆力、抗氧化、抗癌、降血压、减肥降脂等功效，特别是其抗氧化功能对人体健康非常重要，能够减少和清除自由基、抑制脂质过氧化、预防冠心病、抗动脉硬化等[2－4]。苹果也是中国人均消费量最大的水果，约占总水果消费量的四分之一。不同消费者食用苹果的方式不一样，如整果带皮吃、削皮吃、鲜榨果汁以及从超市购买杀菌果汁等，因此如何食用苹果对消费者的健康很重要。

目前对苹果抗氧化活性的研究有很多，如Chinnici[5]、Kelly等[6]发现苹果中果皮抗氧化活性远大于果肉；Eberhardt等[7]将100 g苹果与1.5 g VC进行抗氧化活性测定，发现两者差别极小，且在测定O2－·清除率时发现整果的抗氧化活性高于果肉。然而这些研究均较为零散，多数只单一研究了苹果多酚、黄酮或多糖的抗氧化活性，对苹果抗氧化活性缺乏系统性研究。

本试验模拟消费者对苹果的食用方式来研究不同处理对苹果抗氧化活性的影响，为进一步研究苹果抗氧化成分提供理论依据，同时为消费者如何健康食用苹果提供选择依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果：市售红富士。

芦丁标准品、没食子酸标准品：北京北纳创联生物技术研究院；ABTS：sigma公司；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、抗坏血酸、福林酚、氢氧化钠、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸、DPPH、硫酸亚铁、盐酸、Tris、邻苯三酚、过氧化氢、水杨酸、过硫酸钾（均为国产分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；MJ－L500原汁机：厦门建松电器有限公司；RHCX－350型超声波清洗器：济宁荣汇超声波设备有限公司；TDL－60B低速台式离心机：天津广丰科技有限公司；F2pH计：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；UV1000紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；HH－8数显恒温水浴锅：常州市金坛华特实验仪器有限公司。

1.3 方法

将苹果进行以下处理：

A整果：反复清洗苹果表面，擦干，将其切成细小的块状。

B果皮：削皮，并将果皮切细。

C果肉：将果肉切成细小的块状。

D果汁：整果切块，榨汁，得到果汁。

E杀菌果汁：果汁于80℃水浴10 min，得到杀菌果汁。

F果渣：榨汁后的残渣即为果渣。

分别称取各样品1.00 g，按1∶20（g/mL）的料液比迅速加入80%乙醇溶液，并用保鲜膜封口，在50℃超声30 min，过滤，得到滤液，定容至25 mL，4℃保存，48 h内测定。

1.3.1 VC、总酚、总黄酮的测定

VC参考马宏飞等[8]的方法；总酚测定采用福林酚法，以没食子酸来计算总酚含量；总黄酮测定参考陈志娜等[9]的方法，以芦丁来计算总黄酮。

1.3.2 抗氧化活性测定

1.3.2.1 还原力的测定

还原力参考Tai等[10]的方法，并稍作修改。取1 mL待测液与2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）于10 mL离心试管中，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混匀后放入50℃恒温水浴锅中反应20 min，取出，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，摇匀于3 500 r/min离心10 min。吸取2.5 mL上清液，向其中加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，静置10 min于700 nm波长处测定吸光度，以样品空白做参比。

1.3.2.2 DPPH·清除率的测定

参考Luo等[11]的方法，取2 mL待测液于10 mL试管中，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH－无水乙醇溶液，混匀后在暗处反应30 min，在517 nm处测定吸光度A1，用无水乙醇代替DPPH测定吸光度A2，用无水乙醇代替样品测定吸光度A0。DPPH·清除率的计算公式如下。

1.3.2.3·OH清除率的测定

参考王临宾等[12]的方法，取1 mL待测液于10 mL试管中，依次加入1 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液和1 mL 9 mmol/L水杨酸－乙醇溶液，混匀，再加入1 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液，混匀，在37℃水浴锅中反应30 min，在510 nm处测定吸光度值A1。用蒸馏水代替过氧化氢溶液测定吸光度A2，用蒸馏水代替样品测定吸光度A0。·OH清除率按下面公式计算。

1.3.2.4 O2－·清除率的测定

采用邻苯三酚自氧化法进行测定[13]。取10 mL试管，加入3 mL 50 mmol/L Tris－HCl缓冲溶液中（pH=8.2），置于25℃水浴中预热20 min，分别加入1 mL待测液和0.6 mL 30 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后在25℃中预热5 min，然后加入0.5 mL 1 mol/LHCl溶液，于420 nm处测定吸光度A1。以1mL蒸馏水代替样品作为空白对照，测定吸光度A0，用0.6 mL蒸馏水代替邻苯三酚溶液，测得吸光度A2。按下面公式计算样品对 O2－·清除率。

1.3.2.5 ABTS+·清除率的测定

参考Re等[14]的方法，配制ABTS+·储备液：用2.45 mmol/L过硫酸钾溶液溶解ABTS，配成7 mmol/L ABTS储备液，在室温、避光条件下静置16 h。

配制ABTS测定液：用10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）稀释ABTS储备液，使其吸光度在734 nm波长处达到0.700±0.020。

测定：取4 mLABTS测定液，加入40μL待测液，振荡30 s，静置15 min，于734 nm波长处测定吸光度A1。

1.3.2.6 总抗氧化能力评价

总抗氧化能力：单项抗氧化测定指标中，定义最大值为100%，其他则以其占最大值的比例来表示，最后计算出5项抗氧化测定指标相加后的均值即为总抗氧化能力。

1.4 数据处理与统计分析

采用excel软件处理数据，用SPSS13.0软件中ANOVA进行方差分析，并用LSD法进行多重比较，显著水平为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 不同样品VC、总酚、总黄酮含量变化

不同样品的VC、总酚、总黄酮含量见表1。

表1 不同样品的VC、总酚、总黄酮含量Table 1 Vitamin C content，total phenol content and total flavonoid content in different samples

由表1可知，不同处理下苹果VC含量在3.62 mg/100 g～6.93 mg/100 g范围内。果皮的VC含量最高（6.93 mg/100 g），果渣次之，而其他处理间VC含量差异均不显著（P＞0.05）。出现这样的原因可能是果皮含有维生素B、花青素等色素，在243 nm有紫外吸收，使测定结果偏高。赵谋明等[15]报道了8种不同水果的VC含量，苹果的VC结果与本试验结果相近。

苹果的总酚含量在40.67 mg/100 g～294.43 mg/100 g范围内。果皮总酚含量最高，分别是整果的3倍、果渣的4倍、果肉的4.5倍、果汁的7倍以及杀菌果汁的7.2倍。由此可见处理方式对苹果总酚含量影响显著；除果皮外各处理间虽然差异均显著，但绝对值差异并不大，这说明苹果酚类物质主要分布在果皮中。张桂芝等[16]研究苹果不同部位的多酚含量，发现果皮多酚含量最高，与本文测定值一致。

不同处理对样品总黄酮含量的影响与总酚的一致，这可能是因为多数黄酮类化合物属于酚类物质。果皮的总黄酮含量最高（207.77 mg/100 g），其次是整果、果渣、果肉、果汁，杀菌果汁最低（37.89 mg/100 mL）。Vieira[17]、王岩等[18]报道的结果证明了这点。

2.2 不同样品还原力的大小

不同处理对样品还原力的影响见图1。

图1 不同处理对样品还原力的影响Fig.1 Effects of different treatments on reducing power assay of samples

如图1所示，不同处理间还原力差异显著，且与总酚、总黄酮的显著性一致，说明还原力大小主要由总酚、总黄酮决定。这种差异的原因主要是不同处理造成苹果多酚、黄酮组成不同，从而使Fe3+到Fe2+的还原能力也不同。苹果中果皮酚类成分主要是根皮苷、儿茶素、表儿茶素、芦丁和绿原酸，全果主要以儿茶素、绿原酸和表儿茶素为主，果汁则富含绿原酸[15]。果皮的总酚和总黄酮含量最高，故其还原力最大，这与Petkovsek[19]、张桂芝[16]报道的结果相符。

2.3 不同样品对DPPH·清除效果的影响

不同处理对DPPH·清除能力的影响见图2。

图2 不同处理对DPPH·清除能力的影响Fig.2 Effects of different treatments on DPPH·assay

如图2所示，各样品对DPPH·清除效果较好，均在87.5%以上，其中果皮、整果的清除效果最好，且差异不显著（P＞0.05），可能是与DPPH·单电子配对的抗氧化成分在两者中含量差异不大造成的。其他各处理间均差异显著，可能是因为样品中VC、总酚、总黄酮含量不同，供电子能力也不同。王岩等[18]研究了4种苹果果皮、果肉的抗氧化活性，发现果皮抗氧化活性高于果肉，与本试验结果一致。有研究表明高分子酚类物质对自由基清除能力的贡献约占50%，其余的抗氧化能力主要是由于花青素和黄烷醇的作用[20]，本试验中具体哪些抗氧化成分决定DPPH·的清除能力有待进一步研究。

2.4 不同样品对·OH清除效果的影响

不同处理对·OH清除能力的影响见图3。

图3 不同处理对·OH清除能力的影响Fig.3 Effects of different treatments on·OH assay

由图3可知，苹果对·OH清除率在53%～64%范围内。不同处理下苹果对·OH清除率由高到低的顺序为：果皮＞整果＞果渣＞杀菌果汁＞果汁＞果肉。抗氧化剂通过与Fe2+鳌合，阻止Fe2+催化生成·OH的反应从而达到将·OH清除的目的，出现这种差异的原因主要是抗氧化成分在皮、肉、汁中组成不同，与Fe2+鳌合能力也不同。赵谋明[15]、王岩等[18]的研究表明果皮抗氧化活性高于其他部位，与本文试验结果一致。

2.5 不同样品对O2－·清除效果的影响

不同处理对O2－·清除能力的影响见图4。

图4 不同处理对O2-·清除能力的影响Fig.4 Effects of different treatments on O2-·assay

由图4可知，苹果对O2－·清除率在11%～25%之间，各处理对O2－·清除率的大小顺序为果皮＞整果＞果肉＞果汁＞杀菌果汁＞果渣。邻苯三酚在弱碱条件下迅速发生自氧化，释放出O2－·，生成带颜色的中间产物，当多酚、黄酮等抗氧化物质存在时，提供氢原子给O2－·，抑制中间产物的生成，从而达到清除O2－·的目的。Eberhardt等[7]在O2－·清除率测定中，发现整果抗氧化活性高于果肉，与本文结果不一致，这可能与品种、产地有关。

2.6 不同样品对ABTS+·清除效果的影响

不同处理对ABTS+·清除能力的影响见图5。

图5 不同处理对ABTS+·清除能力的影响Fig.5 Effects of different treatments on ABTS+·assay

ABTS在氧化剂作用下氧化生成绿色的ABTS+·，当抗氧化物质存在时，电子转移到ABTS+·上生成ABTS+，从而清除ABTS+·。根据这一原理，不同处理下各样品对ABTS+·清除率如图5所示。果皮的清除率最高（73.14%），是整果、果渣的3倍左右，是果肉、果汁、杀菌果汁的5倍左右。果肉、果汁和杀菌果汁间差异均不显著（P＞0.05），可能是因为在这反应体系中供电子的抗氧化成分主要存在于果皮中，而果肉、果汁中含量很少。张桂芝[16]报道了苹果不同部位多酚的组成及抗氧化活性，发现苹果多酚分成单体儿茶素类、原花青素类、羟基肉桂酸类以及二氢查耳酮类4类，它们在皮、肉、核的分布不同，从而抗氧化活性也不同，与本试验结果相符。

2.7 不同样品的总抗氧化能力

不同处理对总抗氧化能力的影响见图6。

图6 不同处理对总抗氧化能力的影响Fig.6 Effects of different treatments on total antioxidant activity assay

没有一种单一的方法可以准确评价苹果抗氧化活性，因为不同的方法产生的结果也不同。因此综合评价各样品的总抗氧化能力如图6所示，果汁与杀菌果汁间差异不显著（P＞0.05），与其他各处理均差异显著（P＜0.05），这可能与苹果酚类物质种类、含量有关，羟基数目越多，抗氧化能力越强。Khanizadeh[21]、Lata[22]、Drogoudi等[23]在研究不同基因型苹果时亦发现其皮和肉中酚组成及含量和抗氧化活性均存在显著性差异（P＜0.05），与本试验结果一致。

2.8 各样品的VC、总酚、总黄酮及抗氧化活性之间的相关性分析

VC、总酚、总黄酮及抗氧化活性之间的相关性见表2。

如表2所示，VC、总酚、总黄酮间均极显著正相关（P＜0.01）。VC与 O2－·清除率间差异不显著（P＞0.05），与DPPH·清除率呈显著正相关（P＜0.05），与其他抗氧化活性测定指标呈显著正相关（P＜0.01）；而总酚、总黄酮除与DPPH·清除率显著正相关（P＜0.05）外，与其他抗氧化活性测定指标均极显著正相关（P＜0.01）。说明VC、总酚、总黄酮对苹果抗氧化活性有重要作用。Vieira[17]、徐颖等[24]亦发现总酚含量与抗氧化活性呈显著正相关，与本试验结果一致。

表2 VC、总酚、总黄酮及抗氧化活性之间的相关性Table 2 Correlation coefficients of vitamin C，total phenol，total flavonoid and antioxidant activity

3 结论

通过对苹果进行削皮、榨汁、杀菌等处理，发现不同处理下各样品总抗氧化活性的大小顺序为：果皮＞整果＞果渣＞果肉＞果汁＞杀菌果汁，果皮的VC含量为69.28 mg/100 g，总酚为32.24 mg没食子酸/100 g，总黄酮含量为227.82 mg芦丁/100 g，显著高于其他处理组，说明果皮多酚、黄酮的种类、含量最多，且抗氧化能力最强。VC、总酚、总黄酮与抗氧化活性的显著相关性结果显示，VC、总酚、总黄酮对苹果抗氧化活性至关重要。故为了具有最大抗氧化活性，带皮食用苹果对人体健康有益。采用不同方法测定各样品的抗氧化活性，发现各样品差异显著性不同，因此在不同方法中具体哪些抗氧化成分决定显著性差异有待进一步确定。

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