Galectin-3基因调控Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞凋亡的影响

向 丹 罗 琴

(荆门市中医医院肺病科，湖北 荆门 448000)

肺癌的发生及发展是一个多基因多阶段的过程，研究其病因及发病机制具有重要意义〔1〕。半乳糖凝集素(Galectin)-3参与细胞生长、凋亡、周期调控、损伤及肿瘤转移和转染等过程，在肝癌、乳腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤中过度表达，而抑制其表达可影响肿瘤细胞的增殖及凋亡〔2〕。目前关于Galectin-3对肺癌的影响及机制尚不清楚。RNA干扰(RNAi)是一种能使序列特异性基因转录后发生沉默的现象，是目前研究基因功能有效的方法〔3〕。本研究通过RNAi沉默Galectin-3在肺癌中的表达，研究其对肺癌细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肺癌A549细胞购自上海继和生物科技有限公司。青链霉素、胰酶、胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、Annexin V-FITC凋亡试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；Galectin-3、酶切含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)3、β-链蛋白(catenin)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国abcam公司；CO2细胞培养箱购自美国SIM公司；倒置显微镜购自日本OLYMPUS；酶标仪、电泳凝胶图像分析系统、聚丙烯酰胺凝胶电泳仪均购自Bio-Rad公司。

1.2细胞培养 取出保存在液氮罐中的人肺癌A549细胞，即刻放入37℃的水浴锅中解冻，轻轻摇动使其在1～2 min内溶解。取解冻的细胞在含有10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640细胞培养基置于37℃，5% CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养。细胞汇集率达到80%以上时，用0.25%的胰蛋白酶消化后传代，细胞生长达到对数期后再用于后续的试验研究。

1.3细胞转染 将生长至对数期的人肺癌A549细胞以1×106个/ml浓度接种至6孔细胞培养板中，细胞生长密度达到80%～90%时，将NC-siRNA组(用非特异性siRNA干预细胞)、Galectin-3-siRNA1和Galectin-3-siRNA2组(用Galectin-3-siRNA干预细胞)转染到细胞内，未转染任何的siRNA作为对照组。严格按照Invitrogen 公司的脂质体LipofectamineTM2000方法进行。细胞转染过程中使用无血清培养基，6 h后更换为正常的细胞培养基培养。

1.4转染效果检测 收集转染48 h的细胞，利用细胞蛋白提取试剂盒提取各组细胞中的总蛋白，利用BCA法对总蛋白进行定量，配置12%分离胶及5%的浓缩胶，取50 μg的蛋白样品与上样缓冲液等量充分混匀，100℃变性10 min，取变性蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，电泳结束后电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脱脂奶粉37℃封闭1 h，加入一抗〔Galectin-3 1∶200稀释，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，1∶1 000稀释〕，4℃孵育过夜，然后孵育二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀释)，37℃孵育1 h，洗膜3次，电化学发光(ECL)发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH作为内参，分析Galectin-3的蛋白表达水平。

1.5细胞凋亡检测 取转染48 h的NC-siRNA及Galectin-3-siRNA组细胞，制备单细胞悬液，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)及结合缓冲液各洗涤细胞1次，离心后弃去上清，加入400 μl的结合缓冲液重悬细胞，取细胞沉淀再加入5 μl的PI和 Annexin-V-FITC，37℃避光静置20 min，再加400 μl结合缓冲液，上机，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6Western印迹检测Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达 取转染48 h的上述细胞，提取细胞中的蛋白，根据1.4方法检测各组细胞中Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1的蛋白表达。

1.7统计学方法 应用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1Western印迹检测转染后细胞中Galectin-3的蛋白相对表达 NC-siRNA组Galectin-3的蛋白表达(0.415±0.153)与对照组(0.422±0.164)差异无统计学意义(P>0.05)，Galectin-3-siRNA1、Galectin-3-siRNA2组(0.103±0.009，0.204±0.107)均显著低于对照组(P<0.01)，Galectin-3-siRNA1组的抑制效果更明显，选择作为后续研究。见图1。

2.2抑制Galectin-3的表达对A549细胞凋亡的影响 NC-siRNA组细胞凋亡率〔(2.02±0.35)%〕与对照组〔(1.97±0.29)%〕差异无统计学意义(P>0.05)，Galectin-3-siRNA组〔(15.18±1.23)%〕显著高于对照组(P<0.01)。

2.3Western印迹检测抑制Galectin-3的表达对Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的影响 与对照组及NC-siRNA组比较，Galectin-3-siRNA组β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著下调，Cleaved caspase3蛋白表达显著上调(P<0.01)。见表1，图2。

1～4：对照组，NC-siRNA组，Galectin-3-siRNA 1组，Galectin-3-siRNA 2组图1 Galectin-3在转染后细胞中的蛋白表达

图2 抑制Galectin-3的表达对Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的影响

组别Cleavedcaspase3β⁃cateninCyclinD1对照组0113±00071)0626±00371)0421±00391)NC⁃siRNA组0109±00081)0618±00351)0428±00371)Galectin⁃3⁃siRNA组0157±00070142±00110170±0031

与Galentin-3-siRNA组比较：1)P<0.05

3 讨 论

Galectin-3基因定位于14q21-22染色体上，是Galectin家族的一个重要成员，在肿瘤细胞的胞质、胞膜及正常细胞中均有广泛表达，并可结合细胞内信号分子、整联素、细胞外基质等多种配体，影响细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭等多种生物学效用，对肿瘤的血管生成及肿瘤细胞分化、侵袭和转移等也有调控作用〔4〕，有研究显示，Galectin-3在卵巢癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤中高表达〔5〕。RNA是一种高效、可行的抑制基因表达手段，目前已在信号转导、基因治疗等领域得到应用。有研究显示，RNAi抑制Galectin-3的表达可降低大肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖，促进凋亡〔6〕。本研究结果显示，抑制Galectin-3的表达可显著促进肺癌细胞的凋亡。细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡过程，caspase-3在细胞凋亡过程中发挥重要作用。caspase-3是caspase家族的关键蛋白，在正常组织中主要以无活性的形式存在，不同的凋亡途径最终都会引起caspase-3的活化，活化的caspase-3导致细胞以凋亡的形式解体，目前caspase-3在胃癌、肺癌等多种肿瘤中均有研究〔7，8〕。Wnt信号通路是在进化上相对保守的一条信号传导途径，参与调控细胞的增殖、转移、分化及胚胎发育等多种生命活动过程，可分为经典的Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路，Wnt/β-catenin信号通路是一条经典的Wnt信号通路，与肿瘤、骨质疏松等多种人类疾病密切相关，其异常激活可被调控的相关基因或蛋白改变，从而导致细胞的生长及无限增殖，最终引起肿瘤的发生〔9〕。近年研究显示，Wnt/β-catenin信号通路的激活影响肺癌的发生及发展〔10〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键分子，Cyclin D1是Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因。本研究结果显示，抑制Galectin-3的表达可显著下调β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。

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