白藜芦醇对认知功能损伤大鼠脑组织凋亡蛋白表达的影响

唐 明 赵 欣 魏兴军 杨长路

(天津永久医院急诊科，天津 300450)

阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经系统慢性疾病，表现为学习、记忆能力的下降〔1〕。研究发现导致老年人认知功能障碍的危险因素包括心血管疾病、中年高胆固醇血症、代谢综合征等因素〔2,3〕。研究〔4〕发现，AD患者的脑内凋亡相关蛋白的表达水平发生变化，提示AD患者的认知功能与凋亡蛋白相关。白藜芦醇是从葡萄、虎杖等植物中提取的一种多酚类素质，具有抗凋亡、抗肿瘤及保护心血管等作用〔5,6〕。本文探讨白藜芦醇对AD大鼠的抗凋亡机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 SPF级Wistar大鼠5只作为对照组，早老素(PS)1/淀粉样前体蛋白(APP)双转基因大鼠10只随机均分为AD组和白藜芦醇组，动物购自中国科学院动物研究所。

1.2药品及仪器 白藜芦醇购自西安百川生物科技有限公司，一抗caspase-3、 Bax 和 Bcl，IgG二抗均购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3样品制备 生理盐水、多聚甲醛快速灌注，立即取脑，左脑固定于4%的多聚甲醛，右脑存放于-80℃低温冰箱保存备用。

1.4免疫组织化学染色法检测大鼠脑组织caspase-3、 Bax 和 Bcl蛋白表达 70%酒精3 h→95%酒精3 h→95%酒精过夜→100%酒精脱水2次→透明(二甲苯)→浸蜡→切片(5 μm)→烤箱过夜→二甲苯脱蜡3次→脱水→抗原修复→血清封闭→滴加一抗过夜→加二抗→显色；Western印迹法检测caspase-3、 Bax 和 Bcl蛋白的表达水平，取出脑组织→加入磷酸盐缓冲液(PBS)超声波破碎→离心5 min(12 000 r/min)→取上清→十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳→电转→封闭2 h→一抗4℃孵育过夜→二抗孵育1 h→二氨基联苯胺(DAB)显色。

1.5统计学分析 应用SPSS17.0统计软件进行ANOVA分析。

2 结 果

2.1免疫组织化学检测结果 AD组caspase-3和Bax阳性表达较对照组增强且数目显著增加，Bcl阳性表达显著减弱(P<0.05)；白藜芦醇组caspase-3和Bax阳性表达显著降低，Bcl阳性表达显著增强(P<0.05)。见图1。

2.2Western印迹检测结果 AD组较对照组脑组织内caspase-3、 Bax蛋白水平显著升高，Bcl蛋白水平显著下降(P<0.05)，白藜芦醇组caspase-3、 Bax蛋白水平显著降低，Bcl蛋白水平显著升高(P<0.05)。见图2和表1。

图1 各组脑组织caspase-3、Bax、Bcl表达免疫组织化学染色结果(DAB，×30)

图2 各组脑组织caspase-3、Bax、Bcl蛋白表达

组别caspase⁃3BaxBcl对照组0．0048±0．0010．1071±0．0100．1903±0．025AD组0．1317±0．0311)0．2726±0．0151)0．0879±0．010白藜芦醇组0．0516±0．0082)0．0931±0．0112)0．3164±0．0282)

与对照组比较：1)P<0.05；与AD组比较：2)P<0.05

3 讨 论

目前，AD的发病机制尚不明了，随着医学进步，医学学术界出现了以下学说：神经递质代写障碍、β-淀粉样蛋白、基因、金属离子、神经细胞凋亡等学说〔7～9〕。caspase家族是凋亡相关蛋白，当线粒体收到损伤，线粒体通透性转换开放，细胞色素C释放到胞质中，从而引起caspase级联反应，促进细胞凋亡〔10〕。Bcl是凋亡抑制基因，脑组织中Bcl蛋白表达水平降低将促进神经细胞凋亡。本文提示白藜芦醇可能通过下调促凋亡蛋白caspase-3、 Bax的水平和上调抑制凋亡蛋白Bcl水平调节凋亡相关蛋白表达改善AD大鼠的认知功能。

1Wang Z，Wang L，Yamamoto R，etal.Role of the lateral habenula in shaping context-dependent locomotor activity during cognitive tasks〔J〕.Neuroreport，2013;24(6)：276-80.

2Gessner G，Cui YM，Otani Y，etal.Molecular mechanism of pharmacological activation of BK channels〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2012;109(9)：3552-7.

3Zhang W，Hao J，Liu R，etal.Soluble A13 levels correlate with cogni-tive deficits in the 12.month.old APPswe/PSIdE9 mouse model of Alheimer's disease〔J〕.Behav Brain Res，2011;222(2)：342-50.

4王建平，许栋乾，赵源征，等.白藜芦醇对永久性脑缺血细胞凋亡及Bcl-2表达的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2011；28(12)：1078-81.

5Bai T,Dong DS,Pei L.Resveratrol mitigates isoflurane-induced neuroapoptosis by inhibiting the activation of the Akt-regulatedmitochondrial apoptotic signaling pathway〔J〕.Int J Mol Med,2013;32(3):819-26.

6Akkerman S，Blokland A，Reneerkens O，etal.Object recognition testing：methodological considerations on exploration and discrimination measures〔J〕.Behav Brain Res，2012;232(2)：335-47.

7Alzheimer's Association.2013 Alzheimer's disease facts and figures〔J〕.Alzheimers Dement，2013;9(2)：208-45.

8Zhang Y,Xu Z,Wang H,etal.Anesthetics isoflurane and desflurane differently affect mitochondrial function,learning,and memory〔J〕.Ann Neurol,2012;71:687-98.

9Yang WN，Han H，Hu XD，etal.The effects of perindopril on cognitive impairment induced by d-galactose and aluminum trichloride via inhibition of acetylcholinesterase activity and oxidative stress〔J〕.Pharmacol Biochem Behav，2013;114：31-6.

10Larsen BD,Rampalli S,Burns LE,etal.Caspase-3 activated D Nase promote cell differentiation by inducing DNA strand break〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2010;107(9):4230-5.