LRIG3基因过表达对膀胱癌耐药细胞株顺铂敏感性的作用及机制

倪 钊 王勤章 李应龙 李 强 钱 彪 王新敏 欧阳松 李 晨 董洪超 高存祥 刘志立

(石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，新疆 石河子 832008)

顺铂(CDDP)为膀胱癌化疗方案中的“骨架”药物，随着近年来肿瘤细胞对化疗药物耐药性逐渐增强，膀胱癌患者接受含CDDP化疗方案的完全缓解率明显降低〔1〕。研究发现，化疗过程中肿瘤细胞耐药抵抗与CDDP对表皮生长因子受体(EGFR)信号通路的激活有关〔2〕。动物实验显示，LRIG3基因可负性调节大鼠体内EGFR通路，发挥抑癌作用〔3〕。基于上述研究，本次研究将LRIG3基因转入人膀胱癌耐药细胞株BIU-87使其过表达，以CDDP为细胞凋亡诱导因素，观察BIU-87细胞对CDDP敏感性变化并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人膀胱癌耐药细胞株BIU-87购于上海研域生物科技有限公司；DMEM培养基购于北京北方同正生物技术发展有限公司；CDDP购于(费森尤斯卡比武汉)医药有限公司)；蛋白提取试剂盒、ECL显色试剂盒、逆转录试剂盒、CCK-8试剂盒购于广州健仑生物科技有限公司；EGFR兔抗人多克隆抗体、LRIG3兔抗人多克隆抗体和相应的二抗购于上海信裕生物科技有限公司；委托上海杰美基因医药科技有限公司构建SP-EGFR重组腺病毒载体(含Survivn启动子但不含LRIG3基因)，同时构建SL-EGFR重组腺病毒载体(含Survivn启动子和LRIG3基因)。

1.2细胞培养、分组及转染 将细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基中，放入37℃、5%CO2浓度的培养箱中单层生长，每2天换液1次，取对数期细胞用于实验。实验分为观察组(转染SL-EGFR重组腺病毒载体)，阴性对照组(转染SP-EGFR重组腺病毒载体)，空白对照组。按5×106/孔的密度将BIU-87细胞接种到6孔板，常规培养过夜，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞比例计算感染率。感染率≥60%后按组别分别转染对应的腺病毒载体，感染72 h后收集感染成功率≥60%的细胞提取RNA和蛋白进行检测。CDDP诱导凋亡实验分组：将上述3组细胞给予CODP干预后，分为CDDP组、CDDP/SP-EGFR组、CDDP/ SL-EGFR组，新增未给予CODP干预的空白组。

1.3RT-PCR检测LRIG3和EGFR mRNA表达情况 Trizol法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度法定量浓度和纯度，取2.0 μg总RNA逆转录得到cDNA，行RT-PCR反应。反应条件：94 ℃ 10 min，94℃5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40个循环，72℃延伸10 min。反应产物行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下拍照，以GAPDH为内参计算LRIG3、EGFR mRNA相对表达量。

1.4Western印迹检测LRIG3和EGFR蛋白表达情况 蛋白质提取试剂盒提取各组细胞总蛋白质及核蛋白质，4℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清，-80℃冻存待测。8% SDS-PAGE凝胶上电泳，上样量20 μg，湿法转膜到PVDF，10%脱脂奶粉室温下2 h，滴加兔抗人LRIG3多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗人EGFR及p-EGFR多克隆抗体(1∶2 000)，以兔源性β-actin多克隆抗体(1∶1 000)为内参，室温下反应2 h；洗膜后滴加HRP标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温下反应2 h。ECL显色后用凝胶成像系统读取各条带灰度值。

1.5CCK-8法检测细胞抑制率 将CDDP组、CDDP/ SP-EGFR组、CDDP/ SL-EGFR组细胞按1×107/孔的密度接种到96孔板中，每孔150 μl，培养24 h，弃去培养液，滴加浓度为0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/ml的CDDP，每孔150 μl，设置3个复孔，培养24 h。每孔滴加20 μl CCK-8，培养2 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度值，计算细胞抑制率和半数抑制浓度IC50。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 取对数期BIU-87细胞，按1×107/孔的密度接种到6孔板中，观察贴壁后按分组加入相应浓度的药物，常规培养24 h，取上层悬浮细胞，4℃预冷的磷酸缓冲液冲洗，用稀释的结合缓冲液配成浓度为1×105/孔的单细胞悬液，取6 ml放入流式管中，向每个试管中分别滴加FITC、5 mg/L的碘化丙啶10 μl，室温下避光放置20 min，上流式细胞仪检测，分析细胞凋亡情况。

1.7统计学分析 使用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1重组腺病毒感染BIU-87细胞情况 当感染复数达到25时，荧光显微镜视野下观察组、阴性对照组的BIU-87细胞感染率均≥60%，空白对照组无绿色荧光蛋白表达。见图1。

2.2LRIG3和EGFR mRNA在BIU-87细胞中的表达 观察组LRIG3 mRNA相对表达量为2.80±0.26，明显高于阴性对照组的0.85±0.07和空白对照组的0.73±0.05(P<0.01)；观察组EGFR mRNA相对表达量为0.54±0.06，明显高于阴性对照组的1.87±0.13和空白对照组的2.12±0.06(P<0.01)；阴性对照组与空白对照组LRIG3、EGFR mRNA表达量之间差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.3LRIG3和EGFR 蛋白在BIU-87细胞中的表达 观察组LRIG3 蛋白的相对表达量为1.87±0.23，明显高于阴性对照组的0.94±0.15和空白对照组的1.10±0.18(P<0.01)；观察组EGFR 蛋白的相对表达量为0.83±0.07，明显高于阴性对照组的2.62±0.08和空白对照组的2.53±0.15(P<0.01)；阴性对照组与空白对照组LRIG3、EGFR 蛋白表达量之间差异均无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图1 荧光显微镜观察BIU-87细胞感染情况(×40)

1～3分别为观察组、阴性对照组、空白对照组LRIG3，大小为883 bp；4～6分别为观察组、阴性对照组、空白对照组EGFR，大小为469 bp；M：Marker图2 各组BIU-87细胞中LRIG3和EGFR mRNA表达

图3 各组BIU-87细胞中LRIG3和EGFR 蛋白表达

2.4不同浓度CDDP对各组细胞生长抑制情况及IC50值 CDDP处理24 h后3组细胞生长抑制率均随CDDP浓度增加而升高(见表1)。CDDP/SL-EGFR组细胞IC50值为(14.53±0.42)μg/ml，明显低于CDDP/SP-EGFR组的(31.44±0.59)μg/ml和CDDP组的(30.85±0.67)μg/ml(P<0.01)；CDDP/SP-EGFR组与CDDP组之间差异无统计学意义(P>0.05)。因此，后续实验中CDDP的干预浓度定为30 μg/ml。

表1 不同浓度CDDP对各组细胞抑制率

同组内不同浓度间比较：1)P<0.05

2.5CDDP对各组细胞凋亡情况 流式细胞术检测显示，CDDP/SL-EGFR组细胞凋亡率(70.88±3.25)%，明显高于CDDP/SP-EGFR组的(49.26±2.64)%、CDDP组的(47.93±2.31)%和空白对照组的(3.28±0.38)%(P<0.01)。

2.6LRIG3和CDDP对BIU-87细胞EGFR表达的影响 30 μg/ml CDDP作用24 h后，空白对照组、CDDP组、CDDP/SP-EGFR组、CDDP/SL-EGFR组的BIU-87细胞总EGFR蛋白相对表达量分别为2.63±0.22、1.33±0.06、1.36±0.06、0.43±0.03；p-EGFR蛋白相对表达量分别为1.87±0.13、2.86±0.26、2.93±0.26、1.19±0.05。CDDP组总EGFR蛋白相对表达量明显低于空白对照组，而p-EGFR蛋白相对表达量明显高于空白对照组(P<0.01)。CDDP组与CDDP/SP-EGFR组EGFR蛋白和p-EGFR蛋白相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)；CDDP/ SL-EGFR组EGFR蛋白和p-EGFR蛋白相对表达量明显低于CDDP/SP-EGFR组(P<0.01)。见图4。

图4 各组BIU-87细胞中EGFR和p-EGFR蛋白表达

3 讨 论

含CDDP的化疗方案对膀胱癌敏感性较佳，总有效率可达50%～70%，但近年来随着化疗过程中肿瘤细胞出现的获得性耐药，仅10%～20%膀胱癌患者化疗后症状完全缓解〔4〕。相关研究显示，细胞DNA受损后修复能力提升是导致肿瘤细胞对CDDP耐药的主要原因〔5〕。当处于低氧、紫外线、强氧化物等多种环境下时均可导致DNA损伤，促进EGFR进入细胞核内，上调DNA激酶活性，代谢为有活性的p-EGFR，修复DNA损伤〔6〕。本次研究中未给予CDDP干预的空白对照组细胞核中p-EGFR低表达，而给予CDDP诱导DNA损伤后细胞核中p-EGFR表达水平明显提升，提示CDDP化疗引发的BIU-87细胞DNA损伤介导的EGFR进入细胞核，是引发敏感性降低的原因之一。

LRIGs基因广泛存在于哺乳动物体内，已发现成员包括LRIG1～3，其均可编码结构相似的跨膜糖蛋白，在细胞外存在多个Ig样结构域和亮氨酸序列〔7〕。基础研究显示，人类与鼠LRIGs基因与蛋白存在高度的同源性〔8〕。动物实验发现，LRIG3可在胞外与EGFR直接结合，抑制EGF与其结合，还可提升EGFR对C-cbl的募集与结合，加速EGFR的降解和泛素化，发挥抑制信号传导，促进细胞凋亡的作用〔9〕。本次研究进一步探讨LRIG3对人膀胱癌BIU-87细胞CDDP敏感性的影响机制，结果显示，LRIG3和EGFR 蛋白均表达与BIU-87细胞中，在CDDP诱导下，转染含Survivn启动子和LRIG3基因的CDDP/SL-EGFR组细胞凋亡率明显提升，p-EGFR表达水平明显降低；且转染LRIG3基因后，CDDP对BIU-87细胞的IC50值明显降低。提示LRIG3基因过表达可通过结合并下调p-EGFR水平，阻断CDDP对EGFR通路的激活作用，提升膀胱癌耐药细胞株BIU-87对CDDP的敏感性。

1王 征，耿进成，冯连成，等.吡柔比星与顺铂同步化疗联合放疗治疗老年膀胱癌对患者生存质量的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(4)：787-8.

2Senfter D，Huttary N，Krupitza G,etal.Drug resistance mediated changes in lymphendothelial tumor cell intravasation〔J〕.Int J Clin Pharmacol Ther，2014；52(1)：82-4.

3Easwaran H，Tsai HC，Baylin SB，etal.Cancer epigenetics：tumor heterogeneity，plasticity of stem-like states，and drug resistance〔J〕.Mol Cell，2014；54(5)：716-27.

4陈三三.沉默Cdc6逆转膀胱癌顺铂耐药的实验研究〔D〕.广州：南方医科大学，2016.

5李 诚，兰 莉，杨 超，等.哈尔滨市癌症风险评估系统的构建与应用〔J〕.中国卫生工程学，2016；15(4)：388-9.

6李 倩，苏 宇，陈亚娟，等.姜黄素对人膀胱癌细胞系T24体外侵袭的作用〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2015；16(2)：203-5.

7关云哲，杨东彪，王振中，等.表浅性膀胱癌细胞中DNA核酸内切酶ERCC1及膜连蛋白-1的表达及与顺铂耐药的关系〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(10)：2315-7.

8苏 宇，李 倩，武建辉，等.姜黄素联合阿霉素对膀胱癌 T24生长抑制的协同作用〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2013；14(4)：423-5.

9黄智龙.CYLD通过调节自噬逆转膀胱癌化疗耐药性的机制研究〔D〕.济南：山东大学，2016.