Runx3与Smad4在食管鳞癌中表达和临床意义

王 金 柴 磊 吴艳萍 苗 雨 阮继刚

(宁夏医科大学总医院激光科，宁夏 银川 750004)

食管癌的发生发展是一个多步骤、多基因和多因素共同作用的结果，我国鳞状细胞癌约占总病例的90%。转化生长因子(TGF)-β信号转导通路能够通过阻断细胞从G1期进入S 期而发挥抑制增殖、诱导分化或凋亡的过程，有肿瘤抑制因子的作用。Runx3与Smad4是TGF-β信号转导通路中两个重要的基因，二者的异常表达和多种肿瘤的发生发展及预后有关。本实验旨在探讨Runx3与Smad4在食管鳞癌中的表达差异及意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 2011～2013年在宁夏医科大学总医院肿瘤外科手术切除治疗的60例食管鳞状细胞癌石蜡标本，并收集相应的临床病理资料。年龄43～68岁，平均57.2岁。病例术前均无放疗、化疗及免疫治疗史。40例癌旁组织(距肿瘤边缘5 cm以上且经病理证实不含有食管鳞癌细胞)，其中男32例，女8例，年龄47～63岁。40例正常食管鳞状上皮组织，其中男30例，女10例，年龄45～70岁。消化内科胃镜室取材并经病理切片证实。

1.2主要实验试剂 Runx3鼠单克隆抗体和Smad4鼠单克隆抗体均购自ABCAM公司，免疫组化试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自北京中杉金桥生物制品有限公司。

1.3免疫组化方法及结果判定 严格按照免疫组化SP两步法进行操作，用已知阳性片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲溶液代替一抗作为阴性对照。采用双盲法由两位病理医师观察结果，Runx3、Smad4均主要定位于细胞核和细胞质，呈黄色至棕褐色颗粒。免疫组化染色阳性反应根据照片中染色强度和阳性细胞数目综合判断。染色强度判定：无着色0分，淡黄色1分，黄色2分，棕黄色3分，棕褐色4分。阳性细胞数计数：每张片子5个不同区域，计算染色细胞所占比例：0～10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分。结果按阳性细胞数和染色强度计分相乘，<4分为阴性，≥4分为阳性。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行χ2检验，Spearman等级分析。

2 结 果

2.1Runx3和Smad4在食管鳞癌、癌旁组织、正常组织中的表达 在食管鳞癌组织、癌旁组织及正常组织中，Runx3阳性表达率分别为36.6%、77.5%及82.5%，Smad4阳性表达率分别为41.6%、80%及85%。Runx3和Smad4在食管鳞癌组织中低表达，与癌旁组织和正常组织差异有统计学意义(χ2=27.833、25.348，均P=0.000)。见图1。

2.2Runx3和Smad4在食管鳞癌中的表达与临床病理生物学特征之间的关系 Runx3和Smad4在食管鳞癌中的表达与浸润深度、淋巴结转移及临床分期(TNM)相关(P<0.05)，与患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及组织分化程度无关(P>0.05)。见表1。

2.3Runx3与Smad4的相关性 Runx3与Smad4在食管鳞癌组织中的表达呈正相关(r=0.760，P<0.001)。

图1 3种组织Runx 3、Smad4阳性表达(DAB)

临床病理因素nRunx3(n=22)Smad4(n=25)临床病理因素nRunx3(n=22)Smad4(n=25)性别 男5019(380)21(420)组织分化 低分化196(315)8(421) 女103(300)4(400) 中分化3714(378)15(405) χ2/P值0230/06320014/0907 高分化42(500)2(500)年龄(岁) <603414(414)14(414) χ2/P值1469/02260000/0986 ≥60268(300)11(423)浸润深度 黏膜层及肌层3518(514)20(571) χ2/P值0687/04070008/0930 黏膜层及浆膜外254(160)5(200)部位 上段41(250)2(500) χ2/P值7882/00058278/0004 中段3915(384)16(410)淋巴结转移 有192(105)3(157) 下段176(352)7(411) 无4120(487)22(536) χ2/P值0155/06940110/0740 χ2/P值8182/00047660/0006病变长度(cm) <52810(357)11(390)TNM分期 Ⅰ期+Ⅱ期3919(487)22(564) ≥53212(375)14(430) Ⅲ期+Ⅳ期213(140)3(142) χ2/P值0021/08860122/0726 χ2/P值6969/00089965/0002

3 讨 论

TGF-β信号转导通路由TGF-β超家族、TGF-β受体、胞内信号传导分子Samds蛋白及核内转录调节因子共同组成，主要通过调节组织细胞的生长、增殖、分化、黏附、迁移和凋亡等过程，参与胚胎发育、细胞外基质形成、骨骼生长形成与重建、免疫炎症反应、血管形成、内分泌功能调节、肿瘤发生等〔1〕，是一个高度分化、高效性及多功能性的包含众多成员的细胞因子大家族〔2〕。Runx3是TGF-β信号通路中重要的调控转录因子，在Runx3蛋白的介导下，TGF-β与Smad形成的复合物需从细胞质转入细胞核内。Smad4在 TGF-β信号传导通路中一个关键的细胞内信使，Smad4与R-Smad形成异源复合物向细胞核内转移，起共同调节作用，为信号通路所共享。

Runx3基因功能失调后，其调节TGF-β凋亡传导通路的作用受到抑制，细胞不断恶性增殖、异常分化，Runx3失活机制主要是基因启动子区域CpG岛甲基化〔3〕、杂合性缺失〔4〕或Runx3突变,其活性同时可能也受到多种信号通路的影响，如磷酸化、乙酰化和泛素化降解等。Soong等〔5〕将小鼠敲除Runx3基因,然后将小鼠的胃黏膜上皮细胞接种裸鼠后,裸鼠很快形成肿瘤,说明Runx3蛋白表达缺乏促进了胃癌的发生。在细胞水平，Tonomoto等〔6〕发现，Runx3基因在正常食管黏膜上皮细胞高度表达，而在人食管癌细胞SEG-1中无表达，SEG-1细胞对TGF-β信号通路无应答，但TGF-β对Runx3转染后的SEG-1细胞有抗增殖作用，并且可以诱导细胞凋亡。在基因水平，贾光辉等〔7〕应用原位杂交的方法检测到Runx3 mRNA 在结直肠癌、结直肠腺瘤伴中重度异型增生、结直肠腺瘤伴低度异型增生和癌旁正常组织中的阳性表达率分别为31.67%、39.13%、56.76% 和76.67%，说明Runx3低表达参与了从正常肠黏膜、异型增生(息肉、腺瘤)到结直肠癌细胞形成这一逐渐演变过程。在组织学水平，本研究结果提示Runx3与食管鳞癌的发生发展、侵袭转移及预后有关。

Smad4是肿瘤抑制基因DPC4的产物，于1996年首次在胰腺癌中发现,在TGF-β信号传导通路中起瓶颈作用，Smad4基因突变和缺失导致Smad4蛋白的异常表达，使细胞逃脱TGF-β的生长抑制作用，进而导致肿瘤的发生、发展〔8〕。研究表明Smad4异常表达与胃癌、结直肠癌、宫颈癌〔9〕、脑胶质瘤〔10〕、肺癌〔11〕、膀胱癌〔12〕、肾癌〔13〕、乳腺癌〔14〕、喉癌〔15〕等多种肿瘤有关。本实验发现，Smad4的表达失调在食管鳞癌的发展和侵袭转移中具有重要作用。本研究还发现Runx3与Smad4在食管鳞癌组织中的表达呈正相关，机制可能是上游的Runx3蛋白表达失调，经过连锁反应影响到TGF-β信号传导通路中下游的Smad4蛋白活性，两者在食管鳞癌的发展中可能相互协同，联合检测Runx3和Smad4蛋白表达可能对判断食管鳞癌患者的预后有重要意义。

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