鱼藤酮对MN9D细胞蛋白磷酸酶2A活力的影响①

王屹，杜婷婷，刘舒佳，刘佳，卢勇泉，杨慧

1.中国康复研究中心北京博爱医院，a.检验科；b.脊柱脊髓外科，北京市100068；2.首都医科大学康复医学院，北京市100068；3.首都医科大学附属北京天坛医院，北京市神经外科研究所，北京市100050；4.首都医科大学基础医学院神经生物学系，北京脑重大疾病研究院帕金森病研究所，教育部神经变性病重点实验室，北京市100069

帕金森病是一种与环境、基因、年龄等多种因素相关的疾病，主要特征是神经退行性变引起的运动功能障碍[1-2]。帕金森病的主要病理变化是黑质纹状体通路的破坏及残存多巴胺神经元中形成路易体，主要成分为α-突触核小体(α-synuclein,α-syn)。在帕金森病病理进程中，环境因素和基因因素存在交互作用，环境因素可能加剧帕金森病相关基因的易感性，造成神经元死亡[3]。

鱼藤酮是一种农业生产常用的杀虫剂，与帕金森病发生发展密切相关，被广泛用于帕金森病模型的制备。有文献报道[4-6]，鱼藤酮能提高α-syn丝氨酸129位磷酸化水平，从而导致α-syn聚集。尽管鱼藤酮制备的帕金森病模型是一种能很好重现帕金森病理的模型，并得到一致认可[7-10]，但鱼藤酮引起α-syn病理变化，包括磷酸化水平升高、α-syn聚集的机制尚不明确。

α-syn的磷酸化后修饰与α-syn聚集密切相关。α-syn的磷酸化水平受α-syn激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶去磷酸化活性平衡的调节。α-syn特异性激酶可催化α-syn磷酸化，尤其是129位丝氨酸，并导致路易包涵体中磷酸化的α-syn聚集[11-12]。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是目前发现的唯一α-syn去磷酸化酶。PP2A丝苏氨酸磷酸酶对保持α-syn丝氨酸129位磷酸化和去磷酸化的平衡极其重要[13]。PP2A催化亚基的磷酸化后修饰，能抑制酶的大部分活力[14]。在细胞内，酪氨酸羟化酶使PP2A的催化亚基307位点酪氨酸磷酸化(phosphorylation of tyrosine 307 at the catalytic subunit of PP2A,pY307-PP2Ac)，这一位点是唯一的酪氨酸磷酸化位点。在黑色素瘤细胞中，脂质阀结合操作性Ca2+进入细胞，从而激活钙调素，使钙调素与Src激酶结合，激活Src激酶，从而使PP2A催化亚基307位点酪氨酸发生磷酸化，造成PP2A失活[15]。

研究鱼藤酮能否改变PP2A活性，参与帕金森病的病理过程，将为发现帕金森病的药物作用靶点提供依据。本研究通过鱼藤酮处理MN9D细胞，研究PP2A活性变化的情况，并研究PP2A活性变化对细胞活力变化的影响。

1 材料与方法

1.1 MN9D细胞系

原代小鼠胚胎腹侧中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤细胞系N18TG2融合形成的杂交瘤细胞，由Novartis公司Bastian Hengerer博士惠赠，使用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2 鱼藤酮的制备与细胞分组

称取一定量鱼藤酮，溶于无菌二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，配制终浓度为5 mmol/L储存液，-20℃冰箱避光保存，1周内使用。使用时室温融化，吸取相应的量，在培养基中按照比例稀释成10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L。本研究中，除细胞活力检测外，细胞实验均在直径90 mm培养皿中进行，加培养基10 ml，加鱼藤酮100μl。

实验分组：正常组正常培养细胞；对照组培养液中加入与鱼藤酮组等体积的DMSO；鱼藤酮组培养液中加入不同浓度鱼藤酮培养24 h；鱼藤酮+C2组培养液中先加5μmol/L PP2A特异性激动剂C2-神经酰胺培养0.5 h，再加鱼藤酮50 nmol/L培养8 h后，撤去C2-神经酰胺，再培养至24 h。

1.3 细胞活力检测

MN9D细胞用培养基100 μl按1×104个/孔的密度接种于96孔板。细胞稳定贴壁后，在培养体系中加入适当体积鱼藤酮，使其终浓度分别为10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L。24 h后，各孔加入5 mg/ml噻唑蓝20μl，37℃、5%CO2培养箱继续培养4 h。吸弃培养基，每孔加入DMSO 100μl，避光振荡10 min，使生成的颗粒完全溶解。将孔板置于酶标仪中，读取550 nm波长处吸光度值，统计制图，计算细胞活力。

1.4 Western blotting

在RAPI细胞裂解液中，按100∶1加入复合磷酸酶抑制剂和复合蛋白酶抑制剂；收集细胞，裂解离心，取上清液，BCA法蛋白定量。积层胶80 V、分离胶120 V电泳后，PVDF膜100 mA半干转1 h；将PVDF膜置于10%牛奶封闭液中，室温封闭1 h，依次孵育兔抗pY307-PP2Ac、鼠抗PP2Ac一抗(ABCAM公司，均1∶2000)和兔抗β-actin一抗(SIGMA公司，1∶2000)，以及羊抗鼠680荧光二抗和羊抗兔800荧光二抗(LI-COR公司，均1∶5000)。应用Odyssey红外成像系统(美国LI-CORBIOSCIENCES公司)成像，信号强度用Image J软件(美国National Institutes of Health)分析，以β-actin作为内对照。

1.5 PP2A活性检测

采用PP2A检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)，用试剂盒中的细胞处理液收集细胞，提取蛋白，建立Bradford法测定蛋白浓度标准曲线和蛋白浓度测定。应用分光光度计分别测定样品背景磷浓度、样品总活性磷浓度、非特异活性磷浓度。计算样品特异性活性。

1.6 统计学分析

数据用GraphPad Prism 6.0统计软件进行处理。结果以(xˉ±s)表示，进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 鱼藤酮对细胞及PP2A活性的影响

2.1.1 细胞活力

加入10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L鱼藤酮培养24 h，细胞活力分别为正常组的62.16%(F=27.000,P＜0.001)、 53.69%(F=27.000,P＜0.001)、 47.83%(F=27.000,P＜0.001)、 47.50%(F=27.000,P＜0.001)(图1)。

2.1.2 Western blotting

加入10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L鱼藤酮培养24 h，pY307-PP2Ac水平分别为正常组的99.62%、136.69%、190.20%、158.92%。总PP2Ac水平无明显改变(图2～图4)。

50 nmol/L鱼藤酮组pY307-PP2Ac水平最高，故后续试验鱼藤酮浓度均为50 nmol/L。

图1 各组MN9D细胞活力比较

图2 Western blotting检测结果

图3 各组p Y307-PP2Ac水平比较

图4 各组总PP2Ac水平比较

2.1.3 PP2A活性

鱼藤酮组PP2A活性低于对照组(F=6.000,P=0.027)，见图5。

图5 各组PP2A活性比较

2.2 C2-神经酰胺对鱼藤酮作用的影响

2.2.1 Western blotting

鱼藤酮+C2组pY307-PP2Ac水平为正常组的99.95%，与鱼藤酮组有非常显著性差异(F=8.000,P=0.004)；各组间总PP2Ac水平无显著性差异(图6～图8)。

图6 Western blotting检测结果

图7 各组p Y307-PP2Ac水平比较

图8 各组总PP2Ac水平比较

2.2.2 PP2A活性

鱼藤酮+C2组PP2A活性高于鱼藤酮组(F=4.600,P=0.024)。见图9。

图9 各组PP2A活性比较

2.2.3 细胞活力

鱼藤酮+C2组细胞活力为正常组的74.47%，显著高于鱼藤酮组60.83%(F=28.000,P＜0.001)。图10。

3 讨论

本研究显示，鱼藤酮可通过提高pY307-PP2Ac水平，抑制MN9D细胞PP2A活性，并且这一作用有一定的浓度依赖性。

C2-神经酰胺是PP2A特异性激动剂，通过与PP2A催化亚基C相互作用实现对PP2A的激动[16]。5～20μmol/L神经酰胺可以激活PP2A三聚体[17]。C2-神经酰胺对PP2A的作用是特异的，其他神经酰胺不能激动PP2A[17]。本研究显示，C2-神经酰胺可以改善鱼藤酮造成的细胞PP2A活性下降，这一过程伴随着pY307-PP2Ac水平下调。提示鱼藤酮对pY307-PP2Ac进行调节，参与了鱼藤酮诱导的PP2A活性下降。本实验室此前在SK-N-SH细胞、大鼠原代神经元细胞中也发现相同的作用特点[18]。

神经系统退行性疾病是多因素交互作用的结果，如蛋白聚集、蛋白磷酸化、神经元功能缺失和死亡等。Kelvin C.Luk在野生型非转基因鼠注射合成的α-syn纤维，发现会导致病理性α-syn丝氨酸129位磷酸化的细胞间传递，在解剖接近区域出现帕金森样Lewy病理。丝氨酸129位磷酸化是α-syn的一种重要的翻译后修饰形式。蛋白沉积与蛋白磷酸化具有相关性。α-syn的聚集受α-syn的翻译后修饰影响[19]。α-syn丝氨酸129位磷酸化在体内和体外都通过增加α-syn的聚集而增加其毒性[2]。磷酸化修饰影响α-syn的聚集状态[20]并控制其毒性[21]，使磷酸化α-syn成为帕金森病病理过程中的重要节点[22-23]。PP2A丝苏氨酸磷酸酶对于保持α-syn丝氨酸129位磷酸化和去磷酸化的平衡极其重要。随着研究进一步深入，环境因素与帕金森病重要病理成分的相关性将逐渐被阐明。

鱼藤酮是一种线粒体复合酶Ⅰ抑制剂，影响细胞呼吸链，产生活性氧，对细胞造成毒性作用，常被用于复制帕金森病神经毒性模型[24]。本研究显示，PP2A激动剂C2-神经酰胺在翻转鱼藤酮造成PP2A活性下降的同时，可一定程度改善鱼藤酮造成的细胞活力下降，提示鱼藤酮抑制PP2A活性参与鱼藤酮对细胞活力的抑制。这可能与PP2A参与细胞生长和增殖、细胞凋亡、转录和翻译等多种细胞生命活动有关[25-26]。已有研究表明，某些药物以PP2A为靶向，激活PP2A能减少鱼藤酮诱导的模型鼠运动障碍，并挽救黑质多巴胺能神经元的丢失[27]。

总之，本细胞学研究显示，鱼藤酮通过使PP2A催化亚基307位点酪氨酸发生磷酸化，抑制PP2A活性，PP2A激动剂C2-神经酰胺可以反转鱼藤酮引起的PP2A活性抑制及细胞活力抑制。进一步深入探讨帕金森病的环境危险因素作用于α-syn的内在机制，将α-syn与PP2A相联系，研究鱼藤酮的毒性作用，有助于理解PP2A在帕金森病发病过程中的作用，并发现潜在的药物干预位点。

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