不同电针法对APP/PS1小鼠海马高迁移率族蛋白B1和白细胞介素-10表达的影响①

赵江豪，姚海江，王远征，卢梦晗，李昱颉，宋萌，杨利娟，刘俊彤，李志刚

1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京市100029；2.中国康复研究中心北京博爱医院中医治疗中心，北京市100068；3.首都医科大学康复医学院，北京市100068；4.北京大学第一医院中西医结合科，北京市100084

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)也称“老年性痴呆”，起病隐匿，以老年人(包括老年前期)为多发人群，是一种以认知、记忆能力持续受损和人格改变等为特征的中枢神经系统(central nervous system,CNS)退行性疾病[1]。AD是痴呆发病的最主要类型，在中国可占全部痴呆人群的50%～70%[2]。慢性炎症反应是AD发病过程中的重要病理表现之一[3-4]。小胶质细胞(microglia,MG)作为CNS的天然屏障，是重要的免疫细胞，在AD的病理发展过程中起着推波助澜的重要作用：MG的过度活化，可释放大量致炎蛋白因子，介导神经炎症反应，促使神经元持续受损[5-6]。非甾体类消炎镇痛药可降低AD的风险，减缓疾病进展，进一步佐证炎症反应与AD发病之间存在着密切关系[7-8]。

大量研究证实[9-10]，电针对AD有效。本研究从MG活化角度出发，选取与AD反应密切相关的高迁移率族蛋白B1(high mobility group box protein-1,HMGB1)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)，探讨分析不同电针在“通督启神”针法下对AD治疗效果的差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

7月龄SPF级健康雄性黑色双转基因APP/PS1小鼠32只，购于南京大学南京生物医药研究院模式动物研究所，批准号SCXK(宁)2010-0001，体质量(24.6±4.3)g。饲养于北京中医药大学动物中心屏障系统单笼。根据小鼠体质量标号，随机数字表法分为模型组、药物组、脉冲电针组及音乐电针组各8只；选择8只同月龄相同背景的C57BL/6小鼠作为正常对照组。

1.2 主要试剂与仪器

ZYTH2013030504无菌针灸针，直径0.25 mm、长13 mm：北京中研太和医疗器械有限公司。ZJ-12H音乐电针治疗仪：深圳市圣祥高科技有限公司。HANS-202型韩式电针仪：南京济生医疗科技有限公司。XR-XM101型Morris水迷宫图像自动采集和软件分析系统：上海欣软信息科技公司。自制小鼠束缚套，约8×4 cm，头部用双层纱布缝制。电泳仪：美国BIO-RAD公司。离心机：美国THERMO公司。BX53光学显微镜：日本OLYMPUS公司。石蜡切片机：德国LEICA公司。

二甲苯(分析纯)：北京化学试剂公司。兔抗HMGB1多克隆抗体、大鼠抗IL-10单克隆抗体：英国ABCAM公司。

1.3 方法

脉冲电针组小鼠用束缚套固定，参照实验动物针灸穴位图谱，交叉平刺百会、印堂，两针针体不接触，以防短路，深约0.5 cm，针柄接韩式电针仪，频率2 Hz，强度以小鼠头部稍稍颤动为宜，每次20 min，后点刺人中。每天上午9:00治疗1次，共15 d。

音乐电针组小鼠同法束缚、针刺，选取节奏明朗的痴呆处方干预，以小鼠保持安静不暴躁挣扎为度。

药物组予盐酸多奈哌齐0.92 mg/kg灌胃给药。

正常对照组、药物组和模型组同法抓取并用相同鼠套束缚20 min。

1.4 Morris水迷宫检测

Morris水迷宫水深约29 cm，水温(22±2)℃，加入低糖低脂奶粉使水成为半透明乳白色，以利于摄像分辨为度。水池内水面平均分为4个象限，平台放置于第三象限中央，水面下1 cm。水池上方装备摄像机，将所采集信号传入计算机分析软件系统，进行图像和数据自动采集和处理。

1.4.1 定位航行实验

在水迷宫实验前一天，撤离平台，小鼠在水池内游泳训练90 s。正式实验时，小鼠入水前先将其放在平台上10 s令其熟悉环境；以第一象限池壁中央为入水点，面朝池壁放入水中。小鼠登台停留5 s，自动记录逃避潜伏期；若90 s内小鼠未能登上平台，则逃避潜伏时记为90 s。共测试5 d。

1.4.2 空间探索实验

定位航行实验结束后，拆除平台，将小鼠分别从第一、二、四象限池壁中点相同方法放入池中，记录90 s内小鼠在原平台所在象限的游泳时间与游泳总时间之比。

1.5 HMGB1与IL-10检测

1.5.1 Western blotting

水迷宫测试完毕后，各组随机取4只小鼠，10%水合氯醛0.01 ml/g腹腔注射麻醉，断头处死，取出脑组织，冰袋上分离出大脑海马，存置于灭菌冻存管。将液氮中组织取出，加入蛋白裂解液，测定蛋白含量，取样本30μg，10%SDS-PAGE电泳，半干电转移仪转印至PVDF膜上，5%TBS-T脱脂奶粉封闭震荡60 min，加入 HMGB1 抗体(1∶100)或 IL-10 抗体(1∶2000)4℃孵育过夜。第2天洗膜，加二抗(HMGB1 1∶100，IL-10 1∶2000)37℃震荡孵育1 h；加发光液，曝光后显影清晰时漂洗定影，晾干扫描。用Image-Pro Plus软件对目的条带进行灰度分析，以目的蛋白与β-actin的相对灰度值表示。

1.5.2 免疫组化染色

将其余4只小鼠10%水合氯醛0.01 ml/g腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，左心尖插入针头固定，剪开右心耳，以生理盐水灌注至流出液体清亮，肝脏灰白色；换4%多聚甲醛继续灌注至小鼠躯干、四肢及尾部全部僵硬，取全脑，置4%多聚甲醛中，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片。切片脱蜡，枸椽酸水煮抗原修复10 min，PBS漂洗3遍。3%H2O2常温保湿盒中10 min，PBS漂洗；正常非免疫羊血清室温保湿盒中孵育10 min；加兔抗HMGB1多克隆抗体(1∶1100)或鼠抗IL-10单克隆抗体(1∶50)，4℃冰箱孵育过夜；第2天PBS漂洗，HMGB1使用生物素标记的羊抗兔IgG二抗，IL-10使用生物素标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育10 min，PBS漂洗；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶37℃孵育10 min，PBS漂洗；DAB显色，显微镜下观察并适时终止显色；苏木素复染(HMGB1不复染)，酒精梯度脱水，中性树脂封片。以海马CA1部分为图片分析区域，每组取相互不重叠的6个视野，Image-Pro Plus软件分析系统计数阳性细胞数。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行处理。各数据均以(xˉ±s)表示，水迷宫逃避潜伏期采用重复测量方差分析，水迷宫空间探索测试实验和Western blotting数据呈正态分布，采用单因素方差分析，组间比较选用LSD检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

定位航行实验随着训练时间增加，各组逃避潜伏期呈下降趋势。与正常对照组比较，模型组逃避潜伏期较长(P＜0.05)。前两天药物组、脉冲电针组和音乐电针组均与模型组无显著性差异(P＞0.05)，第3天音乐电针组与模型组有显著性差异(P＜0.05)，第4天以后正常对照组、药物组、脉冲电针组、音乐电针组与模型组均有显著性差异(P＜0.05)，正常对照组逃避潜伏期最短，其次是音乐电针组、脉冲电针组、药物组，模型组最长。见表1。

空间探索实验中，正常对照组目标象限游泳时间比值最高，而后依次是音乐电针组、脉冲电针组、药物组，模型组最低。音乐电针组与脉冲电针组之间无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表1 各组Morris水迷宫定位航行实验逃避潜伏期比较(s)

表2 各组目标象限游泳时间与总时间之比的比较

2.2 Western blotting

与正常对照组比较，模型组HMGB1蛋白表达增加(P＜0.05)；与模型组相比，脉冲电针组和音乐电针组的蛋白表达下降(P＜0.05)；音乐电针组比脉冲电针组无显著性差异(P＞0.05)。见表3、图1。

与正常对照组比较，模型组IL-10蛋白减少(P＜0.05)；与模型组相比，脉冲电针组和音乐电针组的IL-10蛋白表达上升(P＜0.05)；音乐电针组比脉冲电针组间无显著性差异(P＞0.05)。见表3、图2。

图2 各组海马IL-10表达(Western blotting)

2.3 免疫组化染色

正常对照组小鼠海马CA1区HMGB1阳性细胞表达数量最少(P＜0.001)，模型组相同脑区表达最多，主要表达于胞浆和胞外。与模型组比较，脉冲电针组和音乐电针组HMGB1阳性细胞表达下降(P＜0.05)，音乐电针组表达少于脉冲电针组(P＜0.05)。见表4、图3。

正常对照组小鼠海马CA1区IL-10表达最多，模型组表达最少(P＜0.001)，主要为胞质，胞核少量着色。与模型组比较，脉冲电针组和音乐电针组IL-10表达增多(P＜0.05)，音乐电针组表达多于脉冲电针组(P＜0.05)。见表4、图4。

表3 各组海马HMGB1与IL-10表达比较

表4 各组海马HMGB1与IL-10阳性细胞数比较

图3 各组海马HMGB1表达(免疫组化染色,bar=50μm)

图4 各组海马IL-10表达(免疫组化染色,bar=50μm)

3 讨论

研究显示，由于β淀粉样蛋白(betaamyloid,Aβ)沉积引发MG过度活化，其诱发的神经炎症反应在AD神经元凋亡过程中发挥重要作用，可能是AD的发病机制之一[11-12]。MG作为CNS的免疫细胞，具有“双刃剑”效应，既可以监测脑内微环境，抵抗各种损伤，发挥吞噬凋亡细胞碎片的作用；又可诱导、加重CNS炎症反应，从而加速AD发展，加剧神经元破坏和凋亡[13]。MG可在Aβ沉积以及Tau磷酸化等的刺激下，呈M1型极化，胞体发生阿米巴样形态转化，正常吞噬功能减弱，分泌大量致炎因子。MG还具有拮抗炎症反应的M2型极化，大量分泌IL-10、IL-4、IL-13以及转化生长因子-β等，抑制抗炎因子表达，发挥营养和修复作用。

在Aβ持续激活下，MG从静息状态下过度活化、聚集，丧失生理警戒和抵御功能，过度产生的炎性介质加剧神经炎症，造成严重神经毒性，侵蚀损伤神经元，甚至导致其凋亡[14]。激活的MG和死亡的神经元可以释放HMGB1，HMGB1又作用于MG，促进促炎症因子或氧自由基释放，诱发级联放大效应，加重神经炎症，加重认知功能障碍及记忆力减退[15]；同时，HMGB1可以与Aβ结合，形成较难降解的Aβ寡聚体，抑制MG对Aβ的清除[16]。

IL-10作为主要抗炎细胞因子之一，在降低促炎性细胞因子表达的同时，还能促进Aβ清除，从而减轻Aβ诱导的AD样变化[17-18]。

“通督启神”法以百会、印堂、人中三穴作为主穴。该法基于“脑为髓海”，又为元神之府，而“督脉者……上额，交巅，入络脑”，根据脑、神、督脉之间密切联系提出，在治疗精神神志类疾病中取得明显效果。百会是六阳经与督脉交会穴，可调全身神识，为调神第一大穴。叶涛等[19]的研究显示，电针百会可有效改善脑缺血再灌注造成的脑神经损伤。宋长明等[20]的研究证实，电针百会、神庭穴可改善再灌注损伤后大鼠学习记忆能力，并能改善模型大鼠脑内超微结构。印堂居眉心正中，功能镇惊醒神，降逆除烦。人中又名水沟，可沟通阴阳，为急救要穴，主醒神开窍，为诸多神经精神疾患要穴。三穴配合，可以达到“通督启神”的疗效。

音乐电针以电流输出波形模拟音乐节奏的低中频电刺激，电流如音乐般频率和振幅不断变换，避免机体过度适应和耐受。音乐电针不仅具有刺激腧穴和音乐节奏治疗的双重作用，而且克服了以往普通脉冲电针易产生耐受性的缺点，在治疗焦虑、抑郁等神经精神疾病中取得很好效果[21-22]。

我们前期研究已经证实，“通督启神”法两类电针能够降低痴呆小鼠脑内Aβ含量，进而改善其痴呆行为[23-24]。本研究显示，在改善AD模型小鼠空间记忆方面，音乐电针组逃避潜伏期自训练第3天起即明显少于模型组，而脉冲电针组和药物组则在第4天起少于模型组；音乐电针组逃避潜伏期少于脉冲电针组。目标象限游泳时间与总游泳时间之比也有相似的倾向。提示“通督启神”电针可改善APP/PS1小鼠空间记忆，且音乐电针优于脉冲电针，与本课题以往研究一致[25]。“通督启神”电针均可降低AD小鼠海马HMGB1的表达，增加IL-10表达，音乐电针更为明显。

总之，本研究提示，“通督启神”两种电针均为行之有效改善AD的手段，且音乐电针干预效果更优，其作用机制可能与其影响促炎因子HMGB1及抗炎因子IL-10，干预MG两种不同极化有关。但其具体作用机制尚需要进一步研究。

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