雷公藤内酯醇对阿尔茨海默病大鼠海马drebrin和cofilin表达的影响①

张赛圣，杨宝林，程丽霞，万斌，聂菁，胡小令，吕诚

1.南昌大学江西医学院，江西南昌市330006；2.十堰市人民医院，湖北十堰市442000；3.湖北省东风公司总医院，湖北十堰市442008

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以进行性认知障碍和记忆能力损害为主要临床表现的神经系统退行性疾病，其发病机制至今尚未完全阐明[1]。近年来，AD的免疫炎症学说受到越来越多的关注[2]。研究表明，AD的神经病理学特征老年斑的主要成分β淀粉样蛋白(beta amyloid,Aβ)在脑内沉积引发的免疫炎症反应是AD重要的病理机制之一。Aβ可激活脑内小胶质细胞，分泌、释放白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α、补体、一氧化氮等免疫炎性介质[3]。免疫炎性介质可抑制突触传递可塑性的重要指标长时程增强[4]，减少突触相关蛋白的表达，使突触的结构和功能受损[5]。

雷公藤内酯醇具有抗炎、免疫抑制作用。大量研究表明，雷公藤内酯醇具有明确的神经保护作用[6-7]。我们的前期工作也显示，雷公藤内酯醇可以缓解AD大鼠海马神经元树突棘的退化[8]。

树突棘是存在于哺乳动物大脑神经元树突上的小突起，构成约90%兴奋性突触的突触后部分，是信息获得与储存的关键和结构基础。研究表明，树突棘的主要细胞骨架成分是肌动蛋白；肌动蛋白的聚合和/或解聚是树突棘运动、生长和塑形的基础；树突棘形态的改变通过树突棘内肌动蛋白的重排而实现[9]。肌动蛋白的重排主要受肌动蛋白结合蛋白调节，drebrin和cofilin是调节树突棘形态的两个主要肌动蛋白结合蛋白[10-11]。

本研究观察雷公藤内酯醇对AD大鼠模型海马神经元树突棘及drebrin和cofilin表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，4月龄，体质量250～275 g，由南昌大学实验动物科学部提供，动物合格证号赣(动)96-021。实验过程中对动物的处置严格遵守动物伦理准则和使用指南的相关规定。

1.1.2 实验试剂

Aβ1-40：美国SIGMA公司。雷公藤内酯醇(批号070929，纯度99.8%)：福建省医学科学研究所。drebrin鼠抗单克隆抗体：英国ABCAM公司。cofilin兔抗多克隆抗体：美国ANBO生物技术公司。SP试剂盒、DAB显色试剂盒：北京中杉金桥公司。Trizol试剂：美国INVITROGEN公司。RevertAidTMHMinus First Strand cDNA Synthesis Kit：立陶宛FERMENTAS公司。2×Easy Taq PCRSuperMix：北京全式金生物技术有限公司。PCR扩增用引物：南京金斯瑞生物科技公司。硝酸银：上海试剂一厂。

1.2 方法

1.2.1 Aβ1-40的孵育

取Aβ1-400.1 mg溶解于无菌生理盐水20μl，37℃恒温烤箱孵育6 d，终浓度为5μg/μl。

1.2.2 动物分组与药物干预

采用随机数字表法将大鼠分成对照组、模型组和用药组，每组20只。

模型组和用药组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，固定于江湾Ⅰ型C大鼠立体定位仪上，参照《大鼠脑立体定位图谱》，用微量注射器向右侧海马区(前囟后3.0 mm，右侧旁开2.0 mm，硬脑膜下2.9 mm)一次性缓慢注射凝聚态Aβ1-402μl[12-13]。对照组在相同部位注入等容积生理盐水。

雷公藤内酯醇溶解于4%丙二醇溶液中，用药组每天腹腔注射雷公藤内酯醇0.4 mg/kg[8]，共15 d。对照组和模型组腹腔注射等容积4%丙二醇。

治疗结束后，每组取大鼠5只用于Golgi染色，5只用于drebrin免疫组化染色，5只用于cofilin免疫组化染色，5只用于逆转录聚合酶链反应(reverse tran-scription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测。

1.2.3 Golgi染色

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，常规灌注固定，取脑组织置于灌注液中后固定1周。将含注射点的组织块修整厚度为2～3 mm。参照Wan等[8]的方法进行Golgi染色。每个动物在海马注射区附近随机选择9个胞突显示较完整的锥体细胞，采用Image-Pro Plus 5.1显微图像分析系统进行树突棘密度的测定。在1000倍油镜下观察树突棘，从胞体发出的树突第1次分支开始，计算60μm长度范围内树突棘数，计算10μm平均树突棘数。

1.2.4 免疫组化染色

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，常规灌注固定，取脑组织置于灌注液中后固定3 h，置30%蔗糖中，待脑组织完全沉底后在注射点附近行连续冠状冰冻切片，厚20μm。按试剂盒说明书进行免疫组化染色。一抗工作浓度分别为drebrin 1∶100、cofilin 1∶200。用PBS代替一抗进行阴性对照实验。每个动物在海马注射区附近随机取互不重叠的9个视野，在显微镜(100×)下采用Image-Pro Plus 5.1显微图像分析系统测drebrin阳性产物平均光密度和cofilin阳性细胞数和平均光密度。

1.2.5 RT-PCR检测

动物断头处死，快速开颅取脑，取海马组织100 mg，Trizol法提取总RNA，按照逆转录试验盒说明书逆转录成cDNA。

drebrin上游引物5'-CCC CAC GGA GGA CTT GAT-3'，下游引物5'-GGC TGA GGG CAT AGT TAG GA-3'，扩增片段长度454 bp；confilin上游引物5'-TGT GGC TGT CTC TGA TGG AG-3'，下游引物5'-TTG TCT GGCAGCATC TTGAC-3'，扩增片段长度222 bp；以β-actin为内参，上游引物5'-GGTATG GGT CAGAAG GAC TCC-3'，下游引物5'-TGA TCT TCA TGG TGC TAG GAG CC-3'，扩增片段长度857 bp。预变性94℃，5 min；变性94℃，30 s，退火56℃，30 s，延伸72℃，40 s，32个循环；总延伸72℃，10 min。

RT-PCR产物以2.0%琼脂糖电泳，用Image Tool 2.0软件分析结果，目的基因表达强度以目的基因与β-actin的比值表示。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。数据符合正态分布，采用(xˉ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Golgi染色

对照组大鼠海马神经元树突棘数量多而密集，模型组大鼠海马神经元树突棘密度明显低于对照组(P＜0.01)，用药组大鼠海马神经元树突棘密度高于模型组(P＜0.05)。见表1、图1。

2.2 免疫组化染色

drebrin免疫反应阳性产物为棕黄色，呈点状或颗粒状分布于海马神经毡区，海马细胞层缺乏染色。模型组drebrin平均光密度较对照组明显降低(P＜0.01)，用药组drebrin平均光密度较模型组明显升高(P＜0.01)。见表2、图2。

cofilin免疫反应阳性产物为棕黄色，主要分布于海马神经元胞浆内。模型组cofilin阳性细胞数和平均光密度较对照组明显升高(P＜0.01)，用药组cofilin阳性细胞数和平均光密度较模型组减少(P＜0.05)。见表3、图3。

2.3 RT-PCR检测

模型组drebrin mRNA表达明显低于对照组(P＜0.01)，用药组drebrin mRNA表达高于模型组(P＜0.05)。见表4、图4。

模型组cofilin mRNA表达明显高于对照组(P＜0.01)，用药组cofilin mRNA表达明显低于模型组(P＜0.01)。见表4和图5。

表1 各组海马神经元树突棘密度

表2 各组海马神经元drebrin阳性产物平均光密度

表3 各组海马神经元cofilin阳性细胞数和平均光密度

表4 各组海马神经元drebrin和cofilin mRNA表达水平

图1 各组海马神经元树突棘密度(Golgi染色，bar=10μm)

图2 各组海马神经元drebrin免疫反应阳性产物(免疫组化染色，bar=50μm)

图3 各组海马神经元cofilin免疫反应阳性产物(免疫组化染色，bar=50μm)

图4 各组海马神经元drebrin RT-PCR检测结果

图5 各组海马神经元cofilin RT-PCR检测结果

3 讨论

许多证据表明，Aβ对树突棘有毒性作用。Aβ1-42可使培养的小鼠海马脑片树突棘大量丢失[14]。Tg2576和APP/Lo转基因AD模型小鼠海马CA1区锥体细胞树突棘密度明显下降[15]。用高分辨共聚焦显微镜观察AD模型动物和AD患者尸检脑组织中树突和老年斑的关系发现，穿过或距离Aβ纤维聚积部位40μm以内的树突分支出现多种树突异常改变：显著的树突棘丢失，树突干萎缩、弯曲、静脉曲张样变，出芽等[16]。本研究显示，模型组大鼠海马神经元树突棘密度下降。提示Aβ对树突棘有损害作用。

研究表明，Aβ可激活小胶质细胞释放细胞因子、一氧化氮、超氧化物等炎性介质，使Tau蛋白磷酸化，引起细胞骨架重组，阻碍正常微管聚集和轴突稳定，导致突触蛋白和突触丢失[17]；Aβ也可通过激活小胶质细胞释放炎性介质，抑制长时程增强，导致突触功能退化[18]；炎症介质还可抑制脑源性神经营养因子诱导的cofilin磷酸化，阻碍树突棘内肌动蛋白聚合[19]。Aβ对树突棘的神经毒性作用可能与AD脑内免疫炎症反应有关。

drebrin和cofilin是调节树突棘形态的两个主要肌动蛋白结合蛋白。研究表明，drebrin能促进树突棘的生长发育，其作用机制有：①抑制肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用，减少纤维型肌动蛋白的收缩力和树突棘的回缩；②募集profilin(肌动蛋白聚合的启动子)进入纤丝，引起棘延长；③抑制原肌球蛋白和α-辅肌动蛋白，并竞争性与纤维型肌动蛋白结合，调节肌动蛋白骨架网的动力学，进而引起树突棘形态改变。

cofilin能切割纤维型肌动蛋白并加速亚基从纤维型肌动蛋白末端分离，导致纤维型肌动蛋白的快速解聚[10-11]。来自细胞模型、动物模型和患者尸检实验资料表明，AD树突棘内肌动蛋白调节机制受损。柴继侠等[20]发现，原代培养的APP/PS1双转基因AD模型小鼠神经元内Aβ积聚，树突棘蛋白drebrin表达下降。Julien等[21]发现，AD患者脑内drebrin mRNA表达下降与AD病程进展密切相关。Yao等[22]发现，Tg19959转基因AD模型小鼠脑内和原代培养神经元内cofilin表达明显升高。Kojima等[23]认为，AD脑内发生Aβ积聚－drebrin/cofilin病理变化－树突棘形态变化－突触功能障碍－认知能力下降。

本研究显示，模型组大鼠海马神经元drebrin表达减少，cofilin表达增多。与上述文献结果一致，提示树突棘内肌动蛋白调节机制受损可能是AD树突和突触功能异常的重要原因，在AD发病中扮演重要角色。

雷公藤内酯醇是从雷公藤中提取的环氧化二萜内酯类化合物，具有较强的抗炎、免疫抑制作用，在治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、肾脏疾病等自身免疫性疾病方面取得较好疗效。由于AD的炎症发病机制，雷公藤内酯醇可能通过抗炎、免疫抑制机制对AD进行干预。

Cui等[6]发现，雷公藤内酯醇能促进APP/PS1小鼠的学习记忆能力，缓解APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积和神经炎症反应。Wang等[7]发现，雷公藤内酯醇能改善5XFAD转基因AD模型小鼠的学习记忆能力，减少Aβ在脑内的产生和积聚。我们近期的工作表明，雷公藤内酯醇可以减轻AD模型大鼠海马神经元树突棘的损伤性变化[8]。

本研究显示，雷公藤内酯醇可能通过调节drebrin和cofilin的表达，延缓AD模型大鼠海马神经元树突棘的退化，从而对树突棘起保护作用。

由于树突棘的调节机制非常复杂，涉及的因子较多，雷公藤内酯醇对树突棘保护作用的详细机制还有待于进一步深入研究。值得注意的是，雷公藤内酯醇对生殖系统、消化系统、血液系统有一定毒副作用，临床应用有一定局限性[24]。在发挥雷公藤内酯醇神经保护作用的同时，如何降低其毒副作用值得进一步思考。已有文献报道，从雷公藤中分离到一种雷公藤内酯醇的衍生物——雷公藤氯内酯醇。药理活性表明，雷公藤氯内酯醇具有比雷公藤内酯醇更强的抗炎、免疫抑制作用，但其毒性大大低于雷公藤内酯醇[25-26]。雷公藤氯内酯醇对树突棘是否有保护作用，有待于进一步研究。

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