磷脂酰丝氨酸制备关键技术研究

2021-01-16 22:04张群
食品与生物技术学报 2021年2期
关键词:磷脂酶丝氨酸生物酶

磷脂酰丝氨酸(PS)是一种新资源食品,在制药和功能食品领域具有广泛的应用,能够改善老年人的阿尔茨海默病,具有保护神经和抗氧化作用,还具有提高记忆力、缓解紧张、减轻抑郁等功效,为“脑专一性营养物质”。

PS 的制备方法主要有溶剂提取法、化学合成法和酶转化法。酶转化法具有反应条件温和、反应易控、高效简单等优势,逐渐得到广泛的研究及应用。 如,江南大学江波教授团队(2020)采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶层析对广岛链霉菌SK43.001-11 发酵液中的磷脂酶D 进行纯化, 并对双液相体系中酶法制备磷脂酰丝氨酸的工艺进行研究。 结果表明:纯化后,磷脂酶D 比酶活提高到49.48 U/mg,是粗酶液的54.37 倍,回收率为32.31%。磷脂酶D 双液相催化制备磷脂酰丝氨酸的最佳条件为:有机相为乙醚,pH 6.5,反应温度30 ℃,L-丝氨酸与磷脂酰胆碱质量比15∶1,有机相与水相体积比1∶1,反应时间2.5 h。 在最佳条件下,磷脂酰丝氨酸生成率达到74.8%。Liu 等(2014)利用基因工程和分子技术手段将PLD 成功展示在酵母表面,在进行酶转化实验中,可以将67.5%的磷脂酰胆碱转化为PS。中国专利CN201710554483.3 提供了一种催化合成磷脂酰丝氨酸的生物酶及其制备方法和应用,首先构建生物酶的基因工程菌株,将全基因合成的生物酶基因片段,利用限制性内切酶SalⅠ线性化重组质粒,用于表达生物酶,经过进一步发酵获得催化合成磷脂酰丝氨酸的生物酶,利用磷脂酰丝氨酸合成酶高度专一性,催化卵磷脂和丝氨酸制备磷脂酰丝氨酸,转化率达到80%。CN201610054776.0 涉及一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法。其提供了一株谷氨酸棒杆菌基因工程菌,该菌株是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA 基因进行敲除, 并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因pssA 基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变基因serAΔ197 基因和CDP-甘油二酯合成酶的表达基因cdsA 基因而获得, 该菌株经发酵法制备磷脂酰丝氨酸产量较出发菌株提高17%~39%。CN201110382207.6 提供一种酶法制备磷脂酰丝氨酸的方法。 大豆磷脂酰胆碱溶于有机溶剂中,加入一定量溶有2%~8%的丝氨酸水溶液,调节pH 5.6,在磷脂酶D 催化下进行碱基交换,经过4 h 反应,大豆磷脂酰胆碱转化为磷脂酰丝氨酸,反应物通过水洗有机相,经脱水脱溶后,用丙酮充分洗涤, 分离出丙酮不溶物, 干燥得产品。 经过HPLC 测定, 产品磷脂酰丝氨酸的含量大于40%。CN201310508296.3 提供一种制备磷脂酰丝氨酸的方法,包括以下步骤:将磷脂酰胆碱或含有磷脂酰胆碱的天然磷脂与吐温-80、L-丝氨酸、氯化钙、缓冲溶液、磷脂酶D 混合,在35~45 ℃搅拌反应8~10 h;反应结束后反应粗品析出并上浮,离心分离水相和反应粗品,将分离得到的反应粗品用水洗涤,并离心过滤;离心过滤后的反应粗品加入无水乙醇浸泡,搅拌,再离心过滤;对离心过滤后产物真空干燥,即得磷脂酰丝氨酸产品。 CN201710498577.3 公开了一种利用固定化磷脂酶D 生产磷脂酰丝氨酸的方法,配制表面活性剂水溶液,室温下边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清,得混合液;将混合液滴加至金属离子盐溶液中,室温下搅拌反应0.5~2 h 后得固定化的酶溶液;离心,干燥得到固定化的磷脂酶催化剂;将溶于有机相中的卵磷脂、丝氨酸溶液与固定化酶进行转化反应,温度0~40 ℃,时间1~24 h。 CN201910996555.9 提供了一种重组磷脂酶D, 是通过大肠杆菌表面展示技术高通量筛选技术和DNA 基因重组技术筛选获得新型的PLD。CN201710462045.4 涉及一种连续高效酶转化合成食品用磷脂酰丝氨酸的方法。 通过将磷脂酶D 负载于高吸附气凝胶多孔材料,从而提高磷脂酶D 的反应活性和转化催化效能,使得在短时间内完成磷脂酰丝氨酸的催化合成反应;进一步通过高压下在窄流道中进行有机相、水相的反应,不但反应效率高,而且窄流到流体均化反应,反应均匀,易于稳定控制。 CN201410279967.8 涉及一种利用高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D 催化制备sn-2 位为二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(2-DHA-PS)的方法。 通过重叠PCR 技术实现定向进化,获得高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D;利用高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D 催化制备2-DHA-PS,首先磷脂酰胆碱和丝氨酸在高活力磷脂酶D 的催化下生成磷脂酰丝氨酸,然后磷脂酰丝氨酸再与二十二碳六烯酸在高活力磷脂酶A2 的催化下生成2-DHA-PS。

目前国内外研究者主要集中在PS 的提取、生物合成及应用等方面开展研究,而PS 的产品开发应用还处于发展初期。 未来随着绿色生物酶法技术的发展、PS 多种生理保健功能的进一步开发,PS 将在食品、药品领域拥有更广阔的前景。

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