人来源α-1,3/1,6 甘露糖转移酶Alg2 的异源表达及活性测定

胥欣欣， 王春迪， 陈 帅， 高晓冬

（江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

在真核生物中，N-糖基化是一个高度保守的蛋白质修饰过程[1-3]。 该过程发生在内质网上，起始于多萜醇寡糖前体 （Dolichol Linked Oligosaccharide，DLO）的生物合成，其中14 个单糖依次转移到多萜醇焦磷酸 （PP-Dol） 基团上形成核心寡糖前体Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol[2，4-7]。 一系列ER 膜上的糖基转移酶（GTases）统称为Alg（Asparagine-linked glycosylation）蛋白，有序催化DLO 的合成[1，8-9]。 DLO合成的前7 个反应发生在ER 的胞质侧， 生成Man5GlcNAc2-PP-Dol 中间体， 随后会翻转至ER腔内进一步被延伸[10]。 最终，寡糖基转移酶（OST）会将DLO 寡糖前体转移到新生多肽Asn-X-Ser/Thr序列的天冬酰胺（Asn）残基上（X 指除脯氨酸外的氨基酸）[11]。

在N-糖基化途径中，ALG2 基因编码的甘露糖基转移酶具有双功能，催化第二和第三个甘露糖的添加，即以GDP-mannose 为供体，向ManGlcNAc2-PP-Dol 添加α-1，3 和α-1，6 连键的甘露糖， 形成分支结构的Man3GlcNAc2-PP-Dol[12-15]。有文献报道Alg1、Alg2 和Alg11 会形成异聚复合体共同参与胞质侧甘露糖的添加[16-17]。 最初，在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 中， 研究人员通过筛选获得一种温度敏感性突变体alg2-1，它在限制性温度下会积累脂连的Man2GlcNAc2[18]，表明alg2-1 的糖基转移酶存在缺陷， 无法催化α-1，6 甘露糖的添加，继而通过回补实验克隆得到ALG2 基因[19]。 关于人类ALG2-CDG 疾病相关突变体的报道也表明，ALG2 基因是添加α-1，3 连接的甘露糖所必需的[20]。利用表达ScAlg2 的大肠杆菌膜组分，Alg2 的双功能性得到了初步鉴定，后续研究中也进一步利用酵母微粒体膜部分制备的ScAlg2 和纯化的TrxAScAlg2 证明了其可以转移α-1，3/1，6 连键的甘露糖，会以不同的催化速率同时合成α-1，3 或α-1，6连键Man2GlcNAc2PP-Dol 两种中间体[12-13，21]。 最近研究人员成功地将从人类胚胎肾（HEK）293 细胞中纯化的hAlg2 应用于化学酶法生产Man5GlcNAc2-PP-Dol 类似物[22]。

然而， 用动物细胞表达蛋白质成本相对较高。目前， 在大肠杆菌中表达hAlg2 的相关研究鲜有报道。 在真核细胞中，Alg2 的天然底物是Man1GlcNAc2-PP-Dol。 多萜醇（Dolichol）的碳链较长，使得该天然底物的合成和纯化难度较高。 有研究表明，GlcNAc2-PP-Phytanyl （PPGn2） 可被用作Alg1 天然底物的替代物[23]。因此，使用碳链短且结构相似的植烷醇（Phytanol）替代天然底物中的多萜醇是目前的极佳选择。 作者所在课题组曾在大肠杆菌中表达了酵母来源的重组蛋白Alg1ΔTM，详细阐明了其酶学性质， 并成功合成了Man1GlcNAc2-PPPhy（PPGn2M1）[24]作为hAlg2 的底物用以研究其体外活性。

作者利用酿酒酵母生长表型回补系统，对hALG2 基因的体内功能和蛋白质表达进行了分析。此外，利用原核表达系统操作简单，成本低廉的特点， 在大肠杆菌中诱导表达了TrxA-hAlg2 重组蛋白， 并进行了分离纯化。 结合基于LC-MS 的Alg-MTase 体外活性测定法[21，24-26]，对纯化的TrxA-hAlg2进行了体外的活性测定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒和培养基 酿酒酵母w303a 模式菌株：作者所在实验室保藏；大肠杆菌克隆宿主细胞XL10-Gold：作者所在实验室保藏；用于原核表达的大肠杆菌感受态Rosetta （DE3） 和用于原核表达的载体pET28a 和pET32a： 购于默克密理博公司；质粒YEp351GAPII 和pRS315：作者在实验室保藏。

LB 培养基（g/L）：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10；TBK 培养基（g/L）：酵母提取物24，胰蛋白胨12，三水合磷酸氢二钾16.4，磷酸二氢钾2.31；加入体积分数0.4%的甘油。 根据实验需求，可在相应的培养基中加入终质量浓度100 μg/mL 氨苄霉素或34 μg/mL 氯霉素。

YPAD/YPAG 培养基（g/L）：酵母提取物10，蛋白胨20， 腺嘌呤0.03；SD/SG 缺陷型培养基（g/L）：YNB 6.7，氨基酸缺陷粉末2。YPAD 或SD 中额外加入终质量浓度2 g/dL 的葡萄糖；YPAG 或SG 中额外加入终质量浓度2 g/dL 的半乳糖。

1.1.2 主要试剂和仪器 PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶、Mighty Mix DNA 连接酶、 一系列限制性内切酶：购于宝生物工程（大连）公司；GoldView I 型核酸染色剂：购于索莱宝公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），PCR 产物纯化、DNA 胶回收和DNA 小量抽提试剂盒：购于生工生物工程（上海）公司；BCA蛋白浓度试剂盒、SDS-PAGE 蛋白凝胶制备试剂盒： 购于碧云天生物公司；Protease inhibitor cocktail、Anti-FLAG Mouse mAb： 购于西格玛公司；Anti-Dpm1 Mouse mAb： 购于艾博抗公司；Anti-His Mouse mAb、Goat Anti-Mouse IgG HRP、Blue Plus II Protein Marker、1 kb Plus DNA Ladder： 购于全式金生物公司；PCR 仪、凝胶成像仪、半干电转仪：购于伯乐公司；1 mL HisTrap HP 亲和层析柱、ImageQuantTMLAS 4000 mini 显 像 仪： 购 于GE healthcare 公司；NanoDrop2000、 三重四极杆液质连用仪： 购于赛默飞公司； 液相色谱柱粒径1.7 μm，2.1 mm×100 mm：购于沃特世公司。

1.1.3 实验溶液 Lysis buffer （酵母细胞裂解液）：0.2 mol/L 山梨醇，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5）；5×Sample buffer （蛋白质上样缓冲液）：10 g/dL SDS，0.5 g/dL 溴酚蓝，250 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），体积分数50%甘油，5 g/dL β-巯基乙醇；Running buffer（蛋白质RFM 电泳缓冲液）：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.3），192 mmol/L 甘氨酸，0.1 g/dL SDS；Transfer buffer（转膜缓冲液）：25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.3），192 mmol/L 甘氨酸， 体积分数20%甲醇；TBST （洗膜缓冲液）：137 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl （pH 7.6）， 体 积 分 数0.05%Tween-20；Buffer A （E. coli 裂 解 液）：150 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；Buffer B（平衡缓冲液）：150 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），体积分数0.3% Triton X-100；在Buffer B 的基础上，按咪唑浓度20、60、500 mmol/L 配制梯度洗脱缓冲液；Buffer C （除盐液）：50 mmol/L NaCl，25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）， 体积分数5%甘油；Buffer D （活性反应液）：38 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2），1.8 mmol/L DTT，0.28 mmol/L EDTA，0.26 g/dL NP40。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建 质粒YEp351GAPII-FLAGhALG2 的构建如下：以人cDNA 为模板，X22：CGGG AGCTCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGCT CGAGGCGGAGGAGCAGGGCCGGG 和X23：GCTCT AGATTATACCAGCAGTTTGGTAAC 为上下游引物（划线部分依次为Sac I 和Xba I 酶切位点），扩增目的基因FLAG-hALG2。 经Sac I 和Xba I 双酶切后，将片段连入相同酶切的YEp351GAPII。

质粒pRS315-ALG2pr-FLAG-hALG2-ALG2ter的构建如下：以YEp351GAPII-FLAG-hALG2 为模板，X48：TGCTCTAGAATGGACTACAAAGACGATGA 和X19：AAAAAAGCTTTTATACCAGCAGTTTGGTAAC为上下游引物，扩增基因FLAG-hALG2。经Xba I 和Hin d III 双酶切后， 片段连入相同酶切的pRS315-ALG2pr-ALG2ter。

质粒pET32a-hALG2的构建如下：以YEp351GAPIIFLAG-hALG2 为 模 板，X17：CGCGGATCCGCGGAG GAGCAGGGCCGGGA 和X19：AAAAAAGCTTTTAT ACCAGCAGTTTGGTAAC 为上下游引物， 扩增基因hALG2。 经Bam H I 和Hin d III 双酶切后，片段连入相同酶切的pET32a。

1.2.2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的构建 以pFA6a-His3MX6-PGAL1 为模板，X33：TAGATACA GTAGTAAAGACAGATAAAAAAGAGTCGATTAGAC AAGCAAAAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 和X34：CCTAGGTCTGGATGAATAAAAGCAATCGTTCTTTT ATCCTTTTCAATCATTTTGAGATCCGGGTTTT 为上下游引物， 扩增含有酿酒酵母ALG2 启动子区域同源臂和半乳糖启动子的基因片段。 经乙醇沉淀法提取后， 线性转化至野生型酵母w303a 中， 涂布至SD-HIS 缺陷型固体培养基上。 阳性转化子由菌落PCR 和基因组PCR 验证后获得， 上游引物F：CCATAGGATGATAATGCG，下游引物R：TTATATTT CTTCATAAGG。

1.2.3 酵母点板实验 取对数生长期的酵母细胞，OD600在1～3 之间均可。根据分光光度计测量的菌体OD 值， 计算并调节每个样品的起始OD 数相同，用去离子水按10 倍稀释，共4 个梯度，每个梯度分别取5 μL， 依次点于YPAD 或YPAG 固体培养基，30 ℃静置培养36 h。

1.2.4 酵母蛋白质的提取 取对数生长期的酵母细胞，OD600在1～3 之间均可， 收集6～7 个OD 单位的细胞，用1 mL 去离子水洗涤一次。 加入200 μL Lysis buffer 重悬，同时加入适量0.3～0.4 mm 规格玻璃珠1×Protease inhibitor cocktail；振荡1 min，冰上1 min，重复10 次，以下步骤在4 ℃下进行。 1 000 g离心5 min，去除未破碎细胞和细胞碎片。 取上清液200 μL，3 000 g 离心5 min， 进一步去除细胞碎片和细胞核组分，取上清液180 μL 为全细胞蛋白质；13 000 g 离心30 min， 取沉淀为内质网膜组分，用180 μL Lysis buffer 重 悬。 蛋 白 质 浓 度 用NanoDrop2000 测定。

1.2.5 重组蛋白的诱导表达和纯化 将含有原核表达载体pET32a-hALG2 的大肠杆菌Rosetta（DE3）单克隆转化子，接种于5 mL 含氨苄霉素和氯霉素的LB 液体培养基中，37 ℃摇床过夜。 次日，转接2 mL 过夜培养的菌液至200 mL 含卡那霉素和氯霉素的TBK 液体培养基中，37 ℃摇床培养3 h 左右。 测得菌体A600nm达到0.6～0.8 后，16 ℃摇床继续培养1 h。最后加入终浓度0.1 mmol/L IPTG，继续诱导培养20 h。

离心收集所有菌体，20 mL BufferA 重悬后冰上超声破碎；4 000 g 离心20 min， 去除细胞碎片；取上清液20 000 g 离心90 min，取沉淀重悬于10 mL Buffer B，静置30 min；12 000 g 离心30 min，得上清液为膜蛋白，以上过程在4 ℃下完成。

用10 mL Buffer B 过His Trap HP（1mL）亲和层析柱，平衡；取上清液膜蛋白过柱，上样；10 mL Buffer B 去除未结合的蛋白质； 分别用10 mL 含20、60 mmol/L 咪唑和含500 mmol/L 咪唑+体积分数5%的甘油的BufferA 依次洗脱并收集至离心管，利用SDS-PAGE 检测纯化蛋白质。 最后，将含纯化的蛋白质洗脱液加至Amicon Ultra 10 K NMWL 浓缩管， 离心浓缩， 并以BufferC 除盐。 蛋白质浓度由BCA 试剂盒检测。

1.2.6 蛋白质免疫印迹 取适量蛋白质样品，加入对应5×Sample buffer 后混匀，95 ℃处理5 min。根据不同样品的蛋白质浓度，计算并保持所有蛋白质上样量的一致。 装配电泳装置， 加注适量1×running buffer 后上样和蛋白质Marker， 在180 V 恒压条件下运行80 min。 电泳完成后采用半干法转膜，条件设置为25 V、0.1 A、30 min。 转膜完成后，将PVDF膜浸于含5 g/dL 脱脂奶粉的TBST 中封闭， 室温放置1～2 h。 一抗/二抗均稀释于含5 g/dL 脱脂奶粉的封闭液中，一抗稀释比例1∶3 000，二抗稀释比例1∶5 000。 封闭完成后取出PVDF 膜，按顺序加入相应一抗、二抗，抗体孵育时间为室温1～2 h 或4 ℃过夜。 抗体孵育完成后， 用TBST 洗涤PVDF 膜10 min，重复3 次。 取适量ECL 显示剂A 液和B 液，以体积比1∶1 混匀。将显色液均匀散布在PVDF 膜上，静置1 min， 用Image Quant LAS 4000 mini 进行自动曝光拍摄。

1.2.7 体外活性反应体系 PPGn2M1 的合成详见文献[24]。 加入终浓度50 μmol/L PPGn2、2 mmol/L GDP-Man、10 mmol/L MgCl2至Buffer D 中， 终体系为100 μL，加入2 μg 纯化的Alg1NΔTM，30 ℃静置孵育1 h， 得TrxA-hAlg2 的底物PPGn2M1。 对于TrxA-hAlg2 的反应，取上述反应液50 μL，直接加入2.5 μg 纯化的TrxA-hAlg2，30 ℃静置孵育1 h。

1.2.8 LC-MS 检测糖链 向反应体系加入等体积20 mmol/L 盐酸，100 ℃终止反应， 同时酸解释放脂肪链上的糖链后，利用Supelclean ENVI-Carb Slurry对糖链进行固相萃取； 纯化所得糖链经冷冻干燥后，用去离子水重悬；通过超效液相色谱仪Dionex Ultimate 3000 UPLC 自动进样到氨基色谱柱UPLC BEH Amide Column（粒径1.7 μm，2.1 mm×100 mm）中，乙腈线性梯度洗脱（溶液A：乙腈；溶液B：去离子水）。洗脱条件：0～2 min 体积分数20%B；2～15 min，体积分数20%～50% B；15～18 min， 体积分数50%B；流量：0.2 mL/min。 分离所得底物和产物，再经由ESI-MS 仪器TSQ Quantum Ultra 在正离子模式下同步检测相对分子质量。

2 结果与讨论

2.1 人源Alg2 蛋白的疏水性预测

酿酒酵母Alg2（ScAlg2）的N 端含两个跨膜结构域，C 端两个疏水序列以非跨膜方式和内质网结合[13]。 利用在线软件TMpred（https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html） 对hAlg2 进行跨膜预测，结果见图1。 hAlg2 仅在N 端具有一个疏水性区域，位于氨基酸85-104 位，是潜在的惟一内质网膜结合域。

hAlg2 这种膜结合形式与ScAlg2 呈现出明显的差异， 这也就引出了hAlg2 在酿酒酵母中或在大肠杆菌中表达并纯化后，是否和ScAlg2 之间存在差异的疑问。

2.2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的鉴定

在酿酒酵母中，ALG2 是必需基因，直接敲除会导致细胞死亡。 因此，难以实现通过基因敲除获得完全无ALG2 基因背景的菌株。 通过基因改造母株w303a 获得的菌株w303a-GAL1pr-ALG2， 见图2（a）。其基因组上ALG2 自身启动子（ALG2pr）由半乳糖启动子（GAL1pr）取代。该菌株在半乳糖培养基中，ALG2 基因会被表达，细胞能够正常生长；在葡萄糖培养基中，ALG2 基因会被抑制表达， 细胞会死亡。通过观察XGY29 在葡萄糖培养基上的生长表型，可以判断在菌株中外源表达的基因是否具有体内活性。

以图2（a）中所示F、R 为上下游引物，取菌落PCR 验证正确的1 号、2 号单菌落基因组后进一步PCR 验证，均得位于1 500～2 000 bp 之间的单一条带，和理论大小1 753 bp 相符；而野生型（WT）中由于不含引物F 序列，无法扩增出目的带（图2（b））。将w303a-GAL1pr-ALG2 （1 号） 和w303a 点板于YPAD 固体培养基上，前者表现出明显的生长缺陷，即其无法在含有葡萄糖的条件下生长（图2（c））。这些结果说明w303a-GAL1pr-ALG2 菌株构建成功。

图1 hAlg2 蛋白的TMpred 跨膜预测Fig. 1 Transmembrane prediction of hAlg2 protein using TMpred

2.3 h ALG2 在w303a-GAL1pr-ALG2 菌株中的表型回补和蛋白质表达

将融合FLAG 标签的h ALG2 基因分别构建入含 TDH3 强 启 动 子 的 多 拷 贝 （2μ） 质 粒YEp351GAPII（图3（a）、（b））和含酵母ALG2 启动子（ALG2pr）的单拷贝质粒pRS315（图3（c）、（d））中， 构建成功的两种质粒经双酶切后电泳验证，均显示有两个条带，即载体条带和目的基因条带（理论大小为1 281 bp）。

随后，将YEp351GAPII（作为空载对照）和上述两个质粒分别在w303a-GAL1pr-ALG2 菌株中表达。 如图4（a）所示，在YPAG 培养基上，w303a-GAL1pr-ALG2 在分别转入3 种质粒后均能正常生长， 说明这些质粒不影响Sc ALG2 正常表达时细胞的生长； 在YPAD 培养基上， 仅当过表达外源的h ALG2 时，才能回补该菌株的生长缺陷。 提取对应的内质网膜蛋白组分进行免疫印记分析，仅能检测到过表达条件下的hAlg2p 条带 （50 000 左右），见图4（b）。 这些结果说明，h ALG2 基因在酵母细胞中具有功能同源性，而且仅在其过表达的条件下才能发挥功能。

图2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的构建和验证Fig. 2 Construction and verification of w303a-GAL1pr-ALG2 strain

图3 在酵母中表达h ALG2 的质粒构建和验证Fig. 3 Construction and verification of yeast plasmids containing h ALG2

图4 h ALG2 基因在GAL1pr-ALG2 酵母中的回补和表达Fig. 4 Growth recovery and protein expression in GAL1pr-ALG2 strain by h ALG2 gene

2.4 h ALG2 大肠杆菌表达质粒的构建与鉴定

表达质粒pET32a-h ALG2 示意图见图5（a）。经双酶切后电泳验证（图5（b）），显示为两个条带，下端条带大小对应扩增的h ALG2 条带（1 267 bp）；上端条带为载体片段，该质粒经过测序验证无碱基突变，说明表达质粒构建成功。

图5 质粒pET32a-h ALG2 的构建和验证Fig. 5 Construction and verification of pET32a-h ALG2

2.5 TrxA-hAlg2 蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

重组菌Rosetta （DE3）/pET32a-h ALG2 在IPTG终浓度为0.1 mmol/L 的含氨苄霉素抗性的TB 培养基中诱导培养20 h。 离心收集菌体，破碎离心纯化上清液蛋白质，将洗脱后的蛋白质进行蛋白质电泳分析。

理论上目的蛋白质TrxA-hAlg2 的相对分子质量为61 400，如图6（a）所示，相比于诱导前，诱导后在50 000～70 000 之间出现一条明显的蛋白质条带，表明TrxA-hAlg2 蛋白在大肠杆菌中成功表达。纯化后可以得到一条清晰的蛋白质条带，与诱导后条带大小相同。 蛋白质免疫印迹也能检测到对应相对分子质量的纯化后蛋白质（见图6（b）），这说明TrxA-hAlg2 蛋白成功从大肠杆菌破碎上清液中纯化得到。 浓缩除盐处理后得质量浓度为2.5 mg/mL的TrxA-hAlg2 蛋白。

图6 TrxA-h Alg2 蛋白的表达和纯化Fig. 6 Expression and purification of TrxA-h Alg2 protein

2.6 TrxA-hAlg2 蛋白的活性分析

以PPGn2 代替天然底物，GDP-mannose 为供体， 由Alg1NΔTM 催化反应1 h 后，100 ℃下2 min终止反应并灭活Alg1NΔTM。 取一半反应液， 作为TrxA-hAlg2 的反应底物PPGn2M1， 加入纯化后的TrxA-hAlg2 后，继续30 ℃下反应1 h。 最后均向两份反应体系中加入等体积的20 mmol/L HCl，100 ℃下酸解1 h，释放脂肪链上的糖链。 糖链经固相萃取后，进行LC-MS 分析。

对于Alg1NΔTM 的反应， 在UPLC 液相色谱中分别出现8.73、9.03 的峰（见图7（a）），ESI-MS 质谱分析该峰对应的质荷比m/z 为609， 即其反应产物糖链的加钠值[Gn2-M1+Na]+（见图7 （b））。 对于TrxA-hAlg2 的反应，Gn2-M1 对应的峰完全消失，证明底物被TrxA-hAlg2 完全反应； 液相色谱显示在10.57、10.78 和12.25、12.45 有两组峰 （图7（a）），ESI-MS 质谱分析两组峰对应的质荷比m/z 分别为771 和933， 对应其反应产物糖链的加钠值[Gn2-M2+Na]+和[Gn2-M3+Na]+（图7（b））。这些结果说明，在大肠杆菌中表达纯化的TrxA-hAlg2 蛋白同样具有α-1，3/1，6 甘露糖转移酶活性， 即向PPGn2M1上添加两个甘露糖形成PPGn2M3。

图7 TrxA-hAlg2 蛋白的活性测定Fig. 7 Activity assay of TrxA-hAlg2 protein

3 结 语

通过分析发现，人源Alg2 蛋白的84～104 位氨基酸是潜在的惟一膜结合区域，且疏水性较小。 尽管这和酿酒酵母ScAlg2 蛋白的膜拓扑结构完全不同， 但在酿酒酵母中过表达h ALG2 基因时，hAlg2蛋白能稳定表达， 且能够回补Sc ALG2 基因缺失时细胞的生长缺陷。 hAlg2 蛋白在酵母细胞体内的功能同源性和低疏水性的膜蛋白性质，为其在大肠杆菌中的表达纯化和后续活性测定提供理论依据。 作者在大肠杆菌中表达了hAlg2 并对其进行了纯化，相比动物细胞表达体系，成本较低。 在体外活性实验中， 结合LC-MS 技术， 证实hAlg2 具有催化PPGn2M1 形成中间体PPGn2M2 和终产物PPGn2M3的甘露糖基转移酶功能。 对N-糖基化途径中人源的甘露糖基转移酶hAlg2 的外源表达和体外活性进行的研究，为将来进一步探索Alg2 的酶学性质和晶体结构解析奠定了基础。 此外，利用大肠杆菌表达系统提纯的hAlg2， 也为研究ALG2-CDG 病人相关突变体的体外活性提供了更加直接、方便、快捷的方法。