5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与脑梗死患者颈动脉粥样硬化的相关性研究

周浩，魏守超，赵兴军，刘芳，刘志辉

动脉粥样硬化是缺血性血管事件的高危因素，其所致动脉管腔狭窄及斑块脱落所致的血流动力学异常可使脑组织供血区低灌注进而缺血缺氧坏死[1]。以往研究显示，高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血症与5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因677位上碱基C突变为碱基T有关。Hcy代谢相关酶MTHFR基因突变可通过升高Hcy导致动脉粥样硬化的发生[2-3]。本研究旨在探究MTHFR基因多态性与前循环脑梗死患者颈动脉动脉粥样硬化斑块及其稳定性的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集潍坊医学院附属医院神经内科2015年6月-2016年6月住院的新发前循环脑梗死患者，选择同期无脑梗死的门诊体检者作为对照组。本研究经过潍坊医学院附属医院伦理委员会批准。

入组标准：①新发前循环脑梗死，发病2周内，脑梗死符合《中国急性缺血性卒中诊治指南（2014版）》诊断标准[4]；②根据急性卒中治疗低分子肝素试验（Trial of Org 10 172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型[5]为大动脉粥样硬化性脑梗死；③年龄＞18岁；④完成颈部血管超声检查；⑤患者及家属知情同意。

排除标准：①慢性胃肠道疾病、肝肾功能不全、甲状腺疾病、恶性贫血、肿瘤、补充叶酸等对血浆中Hcy水平有影响的因素；②资料不全、中途退出、拒绝参加的患者。

1.2 分组及比较方法 比较脑梗死组与对照组的一般资料、血管危险因素、MTHFRC677T基因型及基因频率分布；将脑梗死组按照颈动脉粥样硬化斑块性质分为稳定斑块组和不稳定斑块组，比较两组MTHFRC677T基因型及基因频率分布。进一步分析脑梗死组中MTHFRC677T基因多态性与颈动脉狭窄程度的相关性。

1.3 一般资料收集 记录所有研究对象的性别、年龄、高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病病史。所有入组者清晨空腹取肘静脉血，采用Olympus 87全自动生化分析仪检测血浆Hcy水平和血脂水平。Hcy≥15 μmol/L，为高Hcy血症。高脂血症各项指标的定义为[6]：总胆固醇＞5.7 mmol/L、甘油三酯＞1.7 mmol/L、低密度脂蛋白胆固醇＞3.3 mmol/L；满足其中一条即可诊断为高脂血症。

1.4 双侧颈内动脉颅外段超声检测 采用西门子2000（探头型号：9L4Multi-D，频率：9MHz）血管超声多普勒仪器，分别观察入组者双侧颈总动脉起始部、主干及分叉部血管内膜有无动脉粥样硬化斑块及斑块性质。

颈内动脉粥样硬化斑块及性质的确认[7]：在颈动脉窦以下1 cm处测量内膜中膜厚度。按照内膜中膜厚度＞1.3 mm判断为颈动脉粥样硬化斑块形成。根据斑块回声强度分为：Ⅰ级低回声脂质型斑块，Ⅱ级等回声纤维型斑块，Ⅲ级强回声或伴声影的钙化型斑块，Ⅳ级回声强弱不均的溃疡型混合斑块。Ⅰ、Ⅳ级为不稳定斑块组；Ⅱ、Ⅲ级为稳定斑块组。有两处或两处以上斑块且性质不同以病变程度较重处为准。

颈动脉狭窄程度的分型[8]：①轻度狭窄，狭窄率＜50%，灰阶图像显示局部斑块形成，管径相对减小，血流无明显变化。②中度狭窄，狭窄率为50%～69%，狭窄段血流出现加速度，狭窄远段病理性涡流形成。③重度狭窄，狭窄率为70%～99%，狭窄段流速进一步升高，狭窄近段流速相对减低，远段出现涡流和湍流混杂的血流信号。④血管闭塞，血流信号消失，无血流通过。若存在两处及两处以上的狭窄，以程度重者为准。

1.5MTHFRC677T基因多态性检测 样本脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的制备：采集静脉血1 ml，加至抗凝管中，用血液基因组DNA提取试剂盒提取和纯化DNA。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增：将MTHFR扩增液分装到0.2 ml薄壁管中做好标记，根据要检测的样本数，选取等量的扩增管，在各扩增管中分别加入1.0 μl的反应液[（Thermus Aquaticus enzyme，Taq）酶、尿嘧啶-N-糖基化（uracil-N-glycosylase，UNG）酶]；在各扩增管中加入2 μl提取好的样品DNA溶液，混匀。然后将各管放入PCR仪中进行扩增，扩增后产物在2～8℃保存。

杂交显色和结果分析：将MTHFR基因芯片放入杂交仪片架中，吸取190 μl杂交缓冲液，加入10 μl PCR扩增产物，混匀制成杂交反应液，加入试管中，放入杂交仪运行杂交程序；反应结束后，取出芯片，将芯片放入生物芯片识读仪中用基因芯片图像分析软件进行图像扫描和数据分析。

基因亚型的判断：MTHFR3种基因型：677CC，677CT和677TT。其中677CC为MTHFR酶222位丙氨酸纯合子，酶活性正常；677CT为MTHFR酶222位丙氨酸/缬氨酸杂合子，酶活性居中；677TT为MTHFR酶222位缬氨酸纯合子，与677CC酶活性相比降低50%～60%。

1.6 统计学方法 应用SPSS 11.5软件进行统计分析，计量资料符合正态分布，用表示，两组间比较采用t检验。计数资料用率表示，两组间比较用χ2检验。MTHFR基因多态性与颈动脉狭窄程度的相关性用Spearman等级相关检验。脑梗死患者多因素分析采用Logistic回归模型，以颈动脉粥样硬化斑块为因变量，以性别、年龄、冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、高血压病、MTHFR基因C677T多态性为自变量，计算自变量的比值比（odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence interval，CI）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 脑梗死组150例，其中男85例，女65例，平均（63.93±7.56）岁。对照组100例，其中男55例，女45例，平均（64.63±7.16）岁。脑梗死组与对照组性别、年龄、吸烟、饮酒、冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病病史等方面均无显著性差异，脑梗死组的高Hcy血症、高血压、高脂血症发病率显著高于对照组（表1）。

表1 两组一般危险因素比较

2.2 脑梗死组与对照组MTHFRC677T基因型及基因频率分布 脑梗死组MTHFRC677T突变（TT）基因型和T等位基因频率均显著高于对照组（分别χ2=22.067，P＜0.001；χ2=6.907，P=0.009）（表2）。

表2 脑梗死组与对照组基因多态性比较

2.3 脑梗死组中MTHFRC677T基因多态性与颈动脉狭窄程度的相关性 脑梗死组CC基因型30例，其中颈动脉无狭窄16例（53.3%），轻度狭窄9例（30.0%），中重度狭窄5例（16.7%）；CT基因型48例，其中颈动脉无狭窄9例（18.8%），轻度狭窄16例（33.3%），中重度狭窄23例（47.9%）；TT基因型组72例，其中无狭窄10例（13.9%），轻度狭窄24例（33.3%），中重度狭窄38例（52.8%）。脑梗死患者MTHFR C677TC→T基因突变与颈动脉狭窄程度呈正相关（r=0.353，P＜0.001）。

2.4 脑梗死组不稳定斑块组与稳定斑块组MTHFRC677T基因型及等位基因频率分布 脑梗死患者中不稳定斑块组71例，稳定斑块组44例，不稳定斑块组MTHFRC677T突变（TT）基因型及T等位基因频率均显著高于稳定斑块组（分别是χ2=14.587，P＜0.001；χ2=6.978，P=0.008）（表3）。

表3 脑梗死患者稳定斑块组与不稳定斑块组间MTHFR C677T基因多态性比较

2.5 脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块形成危险因素多因素分析 将脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块形成为因变量，性别、冠状动脉粥样硬化性心脏病、MTHFR基因C677T多态性、高脂血症和高Hcy血症等脑梗死危险因素纳入Logistic回归方程。结果显示：性别、冠状动脉粥样硬化性心脏病、MTHFR基因C677T多态性、高脂血症和高Hcy血症均是颈动脉粥样硬化斑块形成的危险因素。以C/C基因型为对照，C/T（P=0.001）、T/T（P=0.009）基因型均增加颈动脉粥样硬化斑块形成的机会（表4）。

3 讨论

既往研究发现MTHFR是Hcy代谢的关键酶之一，其存在三种基因型，分别是677CC（正常基因型），677TT（纯合子突变基因型）和677CT（杂合子突变基因型）。编码此酶的基因突变是造成Hcy水平增高及增加动脉粥样硬化和斑块不稳定性的高危因素[9]。MTHFR基因突变可导致MTHFR活性明显下降，引起Hcy升高[10]。Hcy可损伤内皮细胞、促进平滑肌细胞的增殖、改变血液系统的抗凝状态及血小板功能，参与动脉粥样硬化的发生发展过程[11-13]。

目前，MTHFRC677T基因多态性是否与颈动脉粥样硬化相关仍存在着争议。有研究发现，MTHFRC677T等位基因在动脉内弹力层断裂中起一定作用，后者可使平滑肌细胞迁移到内膜中，是早期动脉粥样硬化性器官损害发生发展的独立危险因素[14]。但也有研究者认为MTHFRC677T基因突变虽然可以引起Hcy水平升高，但与动脉粥样硬化并无显著相关性[15]。

表4 颈动脉粥样硬化斑块形成相关危险因素分析

在本研究中，前循环大动脉粥样硬化性脑梗死患者MTHFRC677T突变（TT）基因型和T等位基因频率均显著高于对照组，提示MTHFR的T等位基因频率可能是脑梗死的危险因素。进一步分析显示脑梗死患者MTHFRC677TC→T基因突变与颈动脉狭窄程度正相关，表明MTHFR的T等位基因频率与脑梗死患者颈动脉狭窄程度有关，可能是脑梗死患者颈动脉狭窄的危险因素。刘斌等研究显示[16]，脑梗死组MTHFRC677T突变（TT）基因型及T等位基因频率显著高于对照组，此外，MTHFR的T等位基因频率与脑梗死患者颈动脉狭窄及其程度有关，与本文研究结果一致。

颈动脉粥样硬化斑块的性质与脑梗死的发生密切相关。有研究显示，导致动脉粥样硬化斑块不稳定的内因主要是由于纤维帽厚度、偏心脂质核心大小和坚固性，易于破裂的斑块与纤维帽的细胞外基质胶原的积累和弹性纤维成分的减少[17-19]。本研究显示，脑梗死组中不稳定斑块组MTHFRC677T突变（TT）基因型及T等位基因频率高于稳定斑块组，表明MTHFRC677T突变（TT）基因型及T等位基因频率是脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块不稳定性的高危因素。

以往研究发现[20-21]，补充叶酸可能减轻Hcy对血管的损害，本研究未分析叶酸对患者Hcy水平及颈动脉粥样硬化斑块的影响，后续研究需要完善相关数据。本研究以超声对动脉狭窄进行判断，其准确性低于血管影像学检查，而且操作者之间的不一致性也很难避免；另外，本研究中脑梗死组不是连续入组，可能会对结果造成一定的偏倚。

1 赵康仁，任乃勇，张渭芳，等.彩色多普勒超声检测颈动脉粥样硬化与脑梗死的相关研究[J].临床医学工程，2013，20：129-131.

2 张俊，郭富强.高同型半胱氨酸血症与缺血性脑卒中的研究进展[J].实用医院临床杂志，2013，10：151-154.

3 梅铁芳，李长彬，吕首旭，等.亚甲基四氢叶酸基因多态性与脑梗死[J].中华内科杂志，2002，41：625-629.

4 中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会脑血管病学组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014[J].中华神经科杂志，2015，48：246-257.

5 甄志刚，汪立燕，王晋朝，等.急性脑梗死TOAST分型的相关研究进展[J].实用心脑肺血管病杂志，2011，19：1433-1434.

6 周萍，魏群.老年高血压患者颈动脉粥样硬化与血清同型半胱氨酸、脂蛋白(a)的关系[J].南昌大学学报(医学版)，2013，53：35-41.

7 潘琦，郭立新，初明峰，等.糖尿病患者同型半胱氨酸及其代谢相关酶基因多态性与颈动脉内膜-中膜厚度的关系[J].中国动脉硬化杂志，2005，13：195-198.

8 刘斌，刘昊，伊红丽，等.颈动脉颅外段狭窄及其程度与脑梗死病变部位的关系[J].中国动脉硬化杂志，2005，13：507-508.

9 沈媛，余华峰，陆伯华，等.脑梗死患者同型半胱氨酸、5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与颈动脉粥样硬化的相关性[J].临床荟萃，2011，26：1494-1496.

10 吕海宏，汤旭磊.同型半胱氨酸体内代谢及调节的研究进展[J].当代医学，2015，21：9-14.

11 陈磊，常荣.亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性的研究进展[J].中国循证心血管医学杂志，2016，8：113-115.

12 施洪，刘辉强，郭润达.同型半胱氨酸水平与颈动脉粥样硬化程度斑块稳定性的关系[J].中国实用神经疾病杂志，2013，16：52-53.

13 陈路明，王若丹，帅杰.血中同型半胱氨酸和亚甲基四氢叶酸还原酶C677T基因多态性与脑血管狭窄的关系[J].中国脑血管病杂志，2013，10：119-124.

14 Eaden J，Mayberry J.Guidelines for screening surveillance of asymptomatic colorectal cancer in patients with inflammatoroy bowel disease[J].Gut，2002，51：10-12.

15 Fernando S，Velayo S，Edward V.Predictive and protective factors associated with colorectal cancer in ulcerative colitis：a case-control study[J].Gastroenterology，2006，130：1941-1949.

16 刘斌，田冉，高端，等.同型半胱氨酸代谢酶MTHFR、CBS、MS基因多态性与脑梗死患者颈动脉狭窄的相关性[J].中国现代医学杂志，2011，21：4103-4108.

17 Linnebank M，Moskau S，Semmler A，et al.A possible genetic link between MTHFR genotype and smoking behavior[J].PLoS One，2012，7：e53322.

18 刘立梅，张晓红，刘江涛.颈动脉粥样硬化斑块与脑梗死的相关性分析[J].中国老年学杂志，2009，29：2101-2102.

19 王鹏，吕卫华，刘和锦，等.老年脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块稳定性与红细胞分布宽度的关系[J].中华老年心脑血管病杂志，2013，15：488-491.

20 陈满清，陈景开，周辽军，等.叶酸对同型半胱氨酸致大鼠血管内皮依赖性舒张反应性损伤的保护作用[J].中国微循环，2004，8：160-161，169.

21 Hotoleanu C，Chouky E.Hyperhomocysteinemia and methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism in a patient with coronary artery disease and repetitive miscarriages[J].Rom J Intern Med，2012，50：313-316.