二甲双胍灌胃对支气管哮喘小鼠气道重塑的影响及机制探讨

李小龙，王荣丽

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

二甲双胍灌胃对支气管哮喘小鼠气道重塑的影响及机制探讨

李小龙，王荣丽

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

目的观察二甲双胍灌胃对支气管哮喘小鼠气道重塑的影响，并探讨其可能机制。方法将30只清洁级C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组、模型组、观察组各10只。模型组及观察组于实验第0、7、14天腹腔注射100 μg卵清蛋白(OVA)+2 mg氢氧化铝致敏，并在第21～60 d采用50 μg OVA(3次/周)滴鼻激发建立支气管哮喘模型；对照组以等量生理盐水腹腔注射致敏及滴鼻激发。自第21天起，观察组小鼠灌胃300 mg/(kg·d)，模型组及对照组灌胃等量生理盐水。行HE染色观察肺组织病理情况，masson染色下利用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测算气道基底膜下胶原面积比及支气管壁、平滑肌厚度，ELISA法检测血清转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)，RT-PCR法检测肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA。结果对照组支气管、肺泡等结构相对完整；模型组小鼠见支气管管壁增厚，气道黏膜上皮增生，气管内黏液渗出，肺泡结构破坏等明显；观察组上述改变较模型组明显减轻。与对照组比较，模型组及观察组气道基底膜下胶原面积比、支气管壁厚度、平滑肌细胞厚度增加，血清TGF-β1、MMP-9、TIMP-1水平及肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA表达升高(P均<0.05)；与模型组比较，观察组气道基底膜下胶原面积比、支气管壁厚度、平滑肌细胞厚度减少，血清TGF-β1、MMP-9、TIMP-1水平及肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA表达降低(P均<0.05)。结论二甲双胍可改善支气管哮喘气道重塑，其机制可能为抑制TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达。

哮喘；二甲双胍；气道重塑；转化生长因子β1；基质金属蛋白酶9；基质金属蛋白酶抑制剂1

哮喘也称支气管哮喘，是由多种细胞(气道上皮细胞、平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等)及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，气道高反应性、气道炎症及气道重塑被认为是其主要疾病特征。研究表明，气道平滑肌、气道上皮组织、新血管生成及细胞外基质(ECM)等参与了气道重塑的发生发展。转化生长因子β1(TGF-β1)作为致纤维化最强的一种细胞因子，其与基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)都参与了哮喘气道重塑过程[1]。二甲双胍属双胍类药物，是一种常见的一线治疗糖尿病类药物，其在治疗糖尿病方面发挥重要作用。而近年研究[2,3]发现，二甲双胍不仅在治疗糖尿病方面发挥作用，其在抑制气道炎症方面也发挥重要作用。Li等[4]发现，使用二甲双胍的哮喘患者住院治疗率及急性加重率均较未使用者低。除气道炎症外，气道重塑也被认为是支气管哮喘的另一大疾病特征。那么二甲双胍在治疗哮喘中是否对气道重塑也产生影响目前尚不明确。本研究观察了二甲双胍对支气管哮喘小鼠气道重塑的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级C57BL/6雌性小鼠30只(重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司)，6～8周龄，体质量18～20 g。生理盐水，卵清蛋白(OVA)，氢氧化铝[AL(OH)3]；盐酸二甲双胍片(0.85 g/片)；小鼠血清TGF-β1、MMP-9、TIMP-1 ELISA试剂盒；PCR仪；荧光定量PCR仪；Image-Pro Plus 6.0图像分析系统。

1.2 实验动物分组、支气管哮喘模型制备及二甲双胍给予方法 将30只C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组、模型组、观察组各10只。参照Koh等[5]的方法建立支气管哮喘模型，模型组与观察组分别于第0、7、14天腹腔注射200 μL致敏液[100 μg OVA+2 mg AL(OH)3溶于200 μL生理盐水]，对照组腹腔注射等量生理盐水。自第21～60天，每次在用1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔麻醉后，模型组及观察组给予50 μL激发液(50 μg OVA溶于50 μL生理盐水中)经鼻滴入，每周3次滴鼻，共计18次；对照组则以等量生理盐水滴鼻激发，滴鼻频率与模型组及观察组相同。自第21天起，观察组灌胃300 mg/(kg·d)二甲双胍[2]，对照组及模型组灌胃等量生理盐水。

1.3 肺组织病理组织学观察 在末次激发24 h内，所有小鼠均以眼球摘除取血法处死。处死小鼠后，暴露肺组织，分离并取出左肺上叶，将左肺上叶组织再行脱水、包埋、切片，后行HE染色，光镜下观察肺组织形态、气道重塑、肺泡损伤及炎症细胞浸润等情况。

1.4 气道基底膜下胶原面积比、支气管壁厚度、平滑肌厚度测算 在光镜下(10×20)同一样本随机选取3个视野，测算胶原面积比，采用Image-Pro Plus测量胶原面积、整个图像总面积，计算胶原面积比，胶原面积比(%)=(胶原面积/整个图像总面积)×100%。光镜下(10×20)下选取单个完整的肺支气管横截面，每个标本随机选取3个直径在100～200 μm完整的气道横截面进行测量分析，用Image-Pro Plus(6.0)测量肺完整支气管基底膜周径(Pbm)、支气管总面积(Wat1)、支气管管腔面积(Wat2)、平滑肌外缘内气管面积(Warm1)、平滑肌内缘内气管面积(Warm2)，同时用Pbm将测量值标准化，标准化平滑肌厚度(warn)=(Warm1-Warm2)/Pbm，标准化总管壁厚度(Wat)=(Wat1-Wat2)/Pbm。

1.5 血清TGF-β1、MMP-9、TIMP-1检测 实验小鼠均以眼球摘除取血法处死，摘除眼球时，分别取小鼠血液。血液在3 500 r/min条件下离心10 min，取血清，将收集的血清在-80 ℃环境下保存备用。采用ELISA法检测血清TGF-β1、MMP-9、TIMP-1，按照ELISA试剂盒说明操作。

1.6 肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA检测 处死小鼠后，取出右肺组织，-80 ℃保存，用已经消毒的工具于冰上取约100 mg肺组织，通过TRIzol法充分溶解提取组织总RNA。在逆转录酶的作用下进行反转录，之后再以cDNA(互补脱氧核糖核苷酸)为模板行PCR扩增。PCR扩增引物：GAPDH上游引物：5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，GAPDH下游引物：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；MMP-9上游引物：5′-AAGG GTACAGCCTGTTCCTGGT-3′，MMP-9下游引物：5′-CTGGATGCCGTCTATGTCGTCT-3′；TIMP-1上游引物：5′-CCAGAAATCATCGAGACCACC-3′，TIMP-1下游引物：5′-ATTTCCGTTCCTTAAACGGC-3′。反应体系：10 μL反应体系中含有2×qPCR Mix 5.0 μL、引物工作液(2.5 μmol/L)1.0 μL、模板1.0 μL、蒸馏水2.8 μL、Rox参比染料0.2 μL。反应程序：预变性95 ℃、1 min；然后95 ℃、15 s→58 ℃、20 s→72 ℃、45 s(共循环40次)；熔解曲线60 ℃→95 ℃，每20 s升温1 ℃。结束PCR后，计算目的基因与相对应的内参GAPDH的ΔCt(Ct值之差)，采用ΔΔCT法来计算目的基因的相对表达量。

2 结果

2.1 各组肺组织病理学变化 对照组可见支气管、气道黏膜上皮、肺泡结构完整，气管内未见明显黏液。模型组可见支气管管壁明显增厚，气道黏膜上皮增生，气管内黏液渗出明显，肺泡结构破坏，并伴有大量的炎性细胞浸润。观察组可见支气管及肺泡结构稍完整，支气管管壁稍增厚，炎性细胞渗出较少，同时管腔内黏液渗出不明显。

2.2 各组气道胶原面积比、支气管壁厚度、平滑肌厚度比较 结果见表1。

表1 各组气道胶原面积比、支气管壁厚度、平滑肌厚度比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 各组血清TGF-β1、MMP-9、TIMP-1水平比较 结果见表2。

表2 各组血清TGF-β1、MMP-9、TIMP-1水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.4 各组肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量比较 结果见表3。

表3 各组肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

哮喘是一种以气道慢性炎症为主要特征的疾病，支气管哮喘可引起肺功能进行性损伤及下降，最终导致气道可逆或不可逆的气道阻塞，这些变化则被称为气道重塑。气道重塑作为一种重要的病理特征，其在支气管哮喘的发生发展过程中起重要作用。而气道上皮损伤，气道上皮下纤维化，平滑肌细胞肥大、增生，基底膜下纤维蛋白沉积，基底膜及气道壁增厚，杯状细胞和黏膜下腺体肥大是气道重塑的主要特征[6]。

TGF-β作为一种具有多种功能的调节性细胞因子，主要由肺组织内的上皮细胞、肺巨噬细胞及肺组织外的内皮细胞、巨噬细胞及血小板分泌。TGF-β家族中主要包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中对TGF-β1的研究最为广泛。经过多年研究及实验证实，TGF-β1是具有多种功能的调节性细胞因子，不仅参与了哮喘的慢性气道炎症，同时还在气道重塑中起重要作用。TGF-β1一方面可直接或通过丝裂原激活蛋白酶、结缔组织生长因子等信号通路刺激成纤维细胞的增殖，另一方面还能够促进成纤维细胞合成分泌ECM，促进气道胶原沉积及纤维化[7,8]。

MMP-9作为一种糖化蛋白酶，属于基金属蛋白酶家族中的成员，其主要由巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等分泌。作为基金属蛋白酶家族中的成员之一，由于其与支气管哮喘密切相关而受到大家关注。研究发现，MMP-9与哮喘气道炎症密切相关；另研究表明，在敲除MMP-9相关基因的小鼠哮喘模型与未敲除的小鼠哮喘模型相比较，发现在暴露于变应原后，敲除MMP-9基因小鼠气管周围炎症细胞的浸润及肺泡灌洗液中的炎症细胞均较未敲MMP-9基因小鼠减少，提示MMP-9密切参与了支气管哮喘气道炎症过程[9,10]。除此之外，MMP-9作为调节ECM降解的主要限速酶，还参与了支气管哮喘气道重塑过程。一方面，MMP-9能够降解以Ⅳ型胶原纤维蛋白为主的ECM，从而促进炎性细胞及气道平滑肌细胞(ASM)等细胞迁移，并促进ASM增生、肥大。另一方面，ASM也能产生相当数量的MMP-9，进而形成恶性循环[11]。增生肥大的ASM产生更多的ECM，进而加速支气管哮喘气道重塑的进程。而MMP-9在哮喘气道血管重塑中同样发挥重要作用，其促使平滑肌细胞移至血管基质，使血管表面积增加，促使新血管生成，而上述作用是因为MMP-9能够降解血管中的胶原成分所导致。另外，MMP-9还能够通过促进血管内皮生长因子释放，促进气道基底膜下新生血管形成[12,13]。TIMP-1作为MMP-9特异性的内源性抑制剂，其水平升高可能是机体的一种内源性保护机制，其可抑制MMP-9降解ECM。但抑制MMP-9的活性最终导致基底膜下ECM的增加，从而参与哮喘的气道重塑。

二甲双胍是传统的一线治疗糖尿病药物，不仅在治疗糖尿病方面起重要作用，还在心血管疾病、哮喘等多方面发挥重要作用[4,14]。二甲双胍药理作用的主要分子机制是通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)发挥作用。本研究显示，与模型组比较，观察组气道重塑也得到明显改善，血清TGF-β1水平降低，提示二甲双胍可能通过调节TGF-β1从而发挥作用。根据目前研究来看，二甲双胍可能是通过smad2/3通路及PKM2相关mTOR/p70s6k信号通路参与负性调节TGF-β1，从而参与哮喘气道重塑[15～17]。本研究还发现，与模型组比较，观察组气道胶原面积比、支气管壁厚度、平滑肌厚度减小，血清MMP-9、TIMP-1水平及肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA表达降低，提示二甲双胍在参与支气管哮喘气道重塑的过程中，不仅依赖TGF-β1发挥作用，还通过调节MMP-9、TIMP-1的表达参与气道重塑。二甲双胍降低MMP-9的表达可能是通过AMPK/mTOR信号通路及ERK/INK介导的NF-κB依赖途径而产生作用[18,19]。至于TIMP-1，由于目前缺乏二甲双胍与TIMP-1之间的相关研究，因而目前在哮喘气道重塑中，二甲双胍与TIMP-1之间的联系尚未明确。

总之，二甲双胍可改善支气管哮喘气道重塑，其机制可能为抑制TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达。

[1] Calikoglu M, Unlu A, Tamer L, et al. MMP-9 and TIMP-1 levels in the sputum of patients with chronic obstructive pulmonary disease and asthma[J]. Tuberk Toraks, 2006,54(2):114-121.

[2] Calixto MC, Lintomen L, Andre DM, et al. Metformin attenuates the exacerbation of the allergic eosinophilic inflammation in high fat-diet-induced obesity in mice[J]. PLoS One, 2013,8(10):767-786.

[3] Park CS, Bang BR, Kwon HS, et al. Metformin reduces airway inflammation and remodeling via activation of AMP-activated protein kinase[J]. Biochem Pharmacol, 2012,84(12):1660-1670.

[4] Li CY, Erickson SR, Wu CH. Metformin use and asthma outcomes among patients with concurrent asthma and diabetes[J]. Respirology, 2016,21(7):1210-1218.

[5] Koh YI, Shim JU, Lee JH, et al. Natural killer T cells are dispensable in the development of allergen-induced airway hyperresponsiveness, inflammation and remodelling in a mouse model of chronic asthma[J]. Clin Exp Immunol, 2010,161(1):159-170.

[6] Gras D, Bourdin A, Chanez P, et al. Airway remodeling in asthma: clinical and functional correlates[J]. Med Sci (Paris), 2011,27(11):959-965.

[7] Schaafsma D, McNeill KD, Mutawe MM, et al. Simvastatin inhibits TGFbeta1-induced fibronectin in human airway fibroblasts[J]. Respir Res, 2011,24(12):113-123.

[8] Makinde T, Murphy RF, Agrawal DK. The regulatory role of TGF-beta in airway remodeling in asthma[J]. Immunol Cell Biol, 2007,85(5):348-356.

[9] Cataldo DD, Tournoy KG, Vermaelen K, et al. Matrix metalloproteinase-9 deficiency impairs cellular infiltration and bronchial hyperresponsiveness during allergen-induced airway inflammation[J]. Am J Pathol, 2002,161(2):491-498.

[10] Ma HP, Li W, Liu XM. Matrix metalloproteinase 9 is involved in airway inflammation in cough variant asthma[J]. Exp Ther Med, 2014,8(4):1197-1200.

[11] Elshaw SR, Henderson N, Knox AJ, et al. Matrix metalloproteinase expression and activity in human airway smooth muscle cells[J]. Br J Pharmacol, 2004,142(8):1318-1324.

[12] Lee KS, Min KH, Kim SR, et al. Vascular endothelial growth factor modulates matrix metalloproteinase-9 expression in asthma[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2006,174(2):161-170.

[13] Yuksel H, Yilmaz O, Karaman M, et al. Role of vascular endothelial growth factor antagonism on airway remodeling in asthma[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2013,110(3):150-155.

[14] Xiao H, Zhang J, Xu Z, et al. Metformin is a novel suppressor for transforming growth factor(TGF)-beta1[J]. Sci Rep, 2016,6(10):285-297.

[15] Fan K, Wu K, Lin L, et al. Metformin mitigates carbon tetrachloride-induced TGF-beta1/Smad3 signaling and liver fibrosis in mice[J]. Biomed Pharmacother, 2017,90(12):421-442.

[16] Cheng K, Hao M. Metformin inhibits TGF-beta1-induced epithelial-to-mesenchymal transition via PKM2 relative-mTOR/p70s6k signaling pathway in cervical carcinoma cells[J]. Int J Mol Sci, 2016,17(12):2000-2015.

[17] Park IH, Um JY, Hong SM, et al. Metformin reduces TGF-beta1-induced extracellular matrix production in nasal polyp-derived fibroblasts[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 2014,150(1):148-153.

[18] Li WD, Li NP, Song DD, et al. Metformin inhibits endothelial progenitor cell migration by decreasing matrix metalloproteinases, MMP-2 and MMP-9, via the AMPK/mTOR/autophagy pathway[J]. Int J Mol Med, 2017,29(12):1262-1268.

[19] Hsieh SC, Tsai JP, Yang SF, et al. Metformin inhibits the invasion of human hepatocellular carcinoma cells and enhances the chemosensitivity to sorafenib through a downregulation of the ERK/JNK-mediated NF-kappaB-dependent pathway that reduces uPA and MMP-9 expression[J]. Amino Acids, 2014,46(12):2809-2822.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.011

R562.2

A

1002-266X(2017)47-0038-04

王荣丽(E-mail： scybwrl@sina.com)

2017-07-04)