葛黄颗粒含药血清对乙醇损伤的人肝细胞L-02保护作用观察及其机制探讨

仁德芳，陈柚伶，郎涵，付裕，王洪连，魏嵋，王晓栋，李志

(1西南医科大学中西医结合学院，四川泸州 646000；2西南医科大学附属中医医院)

·论著·

葛黄颗粒含药血清对乙醇损伤的人肝细胞L-02保护作用观察及其机制探讨

仁德芳1,2，陈柚伶1,2，郎涵1,2，付裕1,2，王洪连2，魏嵋2，王晓栋2，李志2

(1西南医科大学中西医结合学院，四川泸州 646000；2西南医科大学附属中医医院)

目的观察葛黄颗粒含药血清对乙醇损伤的人肝细胞L-02修复作用, 并探讨其可能机制。方法①将L-02细胞分为A、B、C、D、E、F组。除F组外，其余各组均加入乙醇培养基培养24 h制备肝细胞损伤模型，造模后吸走培养液。D、F组加入空白血清(10%正常大鼠血清)，A组加入1.25%葛黄颗粒含药血清+8.75%正常大鼠血清，B组加入2.5%葛黄颗粒含药血清+7.5%正常大鼠血清，C组加入5%葛黄颗粒含药血清+5%正常大鼠血清，E组加入5%美他多辛含药血清+5%正常大鼠血清，继续培养6、12、24 h。比较各组细胞上清液谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活力。②将L-02细胞按2×104个/孔接种于6孔板中，将其分为a、b、c、d组。除d组外，其余各组均加入乙醇制备肝细胞损伤模型，造模后吸走培养液。b、d组加入空白血清，a组加入5%葛黄颗粒含药血清，c组加入5%美他多辛含药血清，继续培养24 h。比较各组丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、细胞活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、三磷酸腺苷(ATP)。结果与F组比较，D组各时点AST、LDH升高；与D组比较，B组24 h AST、LDH降低，C、E组12 h和24 h的AST、LDH降低；与A组比较，B组24 h AST降低，C组24 h AST及12 h LDH降低，E组12、24 h AST和LDH降低；与B组比较，C、E组12 h AST、LDH降低；与同组6 h比较，C组24 h AST降低，12、24 h LDH降低；与同组12 h比较，B、C、E组24 h AST降低，C组24 h LDH降低；P均<0.05。与d组比较，b组SOD、GSH-px、MMP、ATP降低，MDA、ROS升高(P均<0.05)；与b组比较，a组和c组SOD、GSH-px、MMP、ATP升高，MDA、ROS降低(P均<0.05)。结论葛黄颗粒含药血清对乙醇致L-02细胞损伤有一定修复作用，其机制可能是调整细胞内氧化应激水平和线粒体功能。

葛黄颗粒；酒精性肝病；人肝细胞；L-02细胞；氧化损伤；线粒体功能

酒精性肝病(ALD)是由于长期过量饮酒所致肝脏损害的一系列病变，是酒精及其代谢产物对肝细胞的直接毒性作用导致的结果。目前，ALD已成为严重危害我国国民健康的一大疾病，其发病率呈逐年增高趋势[1]。葛花解酲汤被记载于金元医家李东垣《脾胃论》一书中，是用于治疗“伤酒”的方剂，可谓解酒名方，具有分消酒湿、健脾理气之功效；葛黄颗粒是由我院孙同郊教授以此方为基础并结合其长期治疗ALD的临床经验总结的经验方“葛黄解酒方”，具有醒酒解毒、清热利湿、健脾疏肝之功效，临床实践中取得了显著疗效。本课题组前期动物实验研究显示，葛黄颗粒可显著降低ALD大鼠模型血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活力，对ALD有较好的防治作用[2]。本研究观察了葛黄颗粒含药血清对乙醇损伤的人肝细胞L-02的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞系 雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，由西南医科大学实验动物中心提供。L-O2细胞，由西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心提供。

1.2 实验药物 葛黄颗粒处方组成：葛花、柴胡、丹参、赶黄草、虎杖、茯苓、白术、枳椇子、甘草等；制成流浸膏，1 mL流浸膏等同于原生药2 g，由西南医科大学附属中医医院制剂室研制供给(批号：20150504)；美他多辛片，由山东齐都药业有限公司生产，规格0.5 g/片(批号：1402002)。

1.3 主要试剂、仪器 胎牛血清，RPMI1640，青霉素-链霉素溶液，活性氧检测试剂盒，线粒体膜电位检测试剂盒，AST测试盒，LDH测试盒，SOD测试盒，GSH-px测试盒，MDA测试盒，ATP检测试剂盒。倒置相差显微镜(TS100)，全自动酶标仪，二氧化碳细胞培养箱，AU 2700全自动生化分析仪，BIOMATE 3S紫外分光光度计，流式细胞仪。

1.4 主要溶液 完全培养基(890 mL/L RPMI1640、100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素-链霉素溶液)，乙醇培养基(860 mL/L RPMI1640、100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青霉素-链霉素溶液、30 mL/L无水乙醇)。

1.5 葛黄颗粒含药血清制备 取SD大鼠60只，适应性喂养1周，后随机分为3组各20只，给药剂量参考《动物与人体的每千克体质量剂量折算系数表》及李仪奎[3]提出的具体给药剂量公式，即葛黄颗粒组为3.1 g生药葛黄颗粒/(100 g·d)，美他多辛组为0.1 g美他多辛/(100 g·d)，空白对照组为等体积蒸馏水，各组每日早、晚各灌胃1次，1 mL/(100 g·次)，连续5 d，末次给药后1 h后各组分别采血并收集血清，过滤除菌、分装，-20 ℃保存备用(注意全程无菌操作)。

1.6 细胞损伤模型制备及葛黄颗粒含药血清对L-02细胞损伤的影响观察 取L-02细胞，将其分为A、B、C、D、E、F组。除F组外，其余各组均加入乙醇培养基培养24 h造模，造模后吸走培养液。D、F组加入空白血清(10%正常大鼠血清)，A组加入1.25%葛黄颗粒含药血清+8.75%正常大鼠血清，B组加入2.5%葛黄颗粒含药血清+7.5%正常大鼠血清，C组加入5%葛黄颗粒含药血清+5%正常大鼠血清，E组加入5%美他多辛含药血清+5%正常大鼠血清，继续培养6、12、24 h。收集细胞上清液，采用全自动生化分析仪检测细胞上清液AST、LDH活力。

1.7 细胞损伤模型制备及葛黄颗粒含药血清对L-02细胞损伤影响的作用机制观察 取L-02细胞，按2×104个/孔接种于6孔板中，将其分为a、b、c、d组。除d组外，其余各组均加入乙醇造模，造模后吸走培养液。b、d组加入空白血清，a组加入5%葛黄颗粒含药血清，c组加入5%美他多辛含药血清，继续培养24 h。收集细胞，超声破碎裂解部分细胞，分别采用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法及赖氏法检测各组细胞内丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活力，部分细胞通过流式细胞仪检测细胞细胞内活性氧(ROS)水平，JC-1法检测细胞内线粒体膜电位(MMP)水平，全自动酶标仪检测细胞内三磷酸腺苷(ATP)含量，严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 各组细胞上清液AST、LDH活力比较 结果见表1。

表1 各组细胞上清液AST、LDH活力比较

注：与F组比较，aP<0.05；与D组比较，bP<0.05；与A组比较，cP<0.05；与B组比较，dP<0.05；与同组6 h比较，eP<0.05；与同组12 h比较，fP<0.05。

2.2 各组细胞SOD、GSH-px活力及MDA、ATP含量和ROS、MMP水平比较 结果见表2。

表2 各组细胞SOD、GSH-px活力及MDA、ATP含量和ROS、MMP水平比较

注：与d组比较，aP<0.05；与b组比较，bP<0.05。

3 讨论

葛黄颗粒主要包含葛花、柴胡、丹参、赶黄草、虎杖、茯苓、甘草等。现代药理学研究表明，葛花中富含大量的黄酮类和皂苷类化合物，具有很强的抗氧化作用，能有效清除体内自由基，促进人体正常的新陈代谢，其促进酒精代谢及护肝作用与这些物质密切相关[4]。槲皮素是赶黄草主要有效成分之一，具有较强的抗氧化、清除氧自由基、降糖、降脂及降压的作用[5～7]。柴胡皂苷是中药柴胡中提取出的有效成分，能增强机体抗氧化防御能力，从而抑制自由基的产生，达到稳定肝细胞膜系统，促进肝细胞生长，防止肝细胞损伤和坏死[8]。虎杖的主要活性成分白藜芦醇是一种天然抗氧化剂，同时还具有抗炎症、抗过敏、调节免疫等药理活性[9]。上述研究均提示葛黄解酒方的保肝作用可能与抗氧化有关。

AST、ALT、LDH主要存在于肝细胞的胞质和线粒体，当肝细胞受损时，肝细胞膜破坏、通透性增加，AST、ALT、LDH从细胞内大量泄漏，故AST、ALT、LDH能反映肝细胞损伤程度。同时，AST、ALT是ALD诊断的重要临床指标[10]。

ALD存在多种发病机制，如乙醇氧化的代谢效应、机体的氧化应激状态、乙醇及其代谢产物乙醛的自身毒性、免疫与炎症反应相关机制凋亡等[11～14]。乙醇在肝细胞分解代谢，诱导产生大量氧自由基，消耗体内抗氧化剂(SOD、GSH-px)，氧自由基的产生不能被抗氧化剂及时清除，氧化-抗氧化系统失去原有平衡，肝细胞内活性氧ROS的蓄积逐渐增多，造成氧化应激损伤。乙醇在氧化过程中产生的氧自由基，特别是羟自由基将破坏细胞和细胞器生物膜中的不饱和脂肪酸，诱发脂质过氧化，产生脂质过氧化物MDA，造成多个细胞器功能障碍。当线粒体膜受到损伤后，线粒体膜电位去极化，质子从非特异性部位渗漏回基质，氧化磷酸化反应出现障碍，导致ATP的合成障碍，影响细胞能量代谢[15]，导致细胞损伤和凋亡。其中MDA作为脂质过氧化反应的终产物，反映氧化应激导致的细胞膜损伤程度[16～18]。总之，乙醇诱导L-02细胞线粒体发生氧化应激时，产生大量的ROS，消耗体内抗氧化剂(SOD、GSH-px)，诱发生物膜脂质过氧化，产生脂质过氧化物MDA，损伤生物膜，引起线粒体功能障碍，导致线粒体膜电位下降，从而使ATP生成减少，出现能量代谢障碍，同时又进一步加重ROS的蓄积，形成恶性循环[19,20]。因此，减轻ROS的蓄积、提高机体抗氧化水平、减少生物膜脂质过氧化、维持线粒体的膜电位水平是避免肝细胞内发生能量代谢障碍、减轻肝细胞的损伤、抑制肝细胞凋亡的重要途径。

本研究显示，与F组比较，D组各时点AST、LDH升高；与D组比较，B组24 h AST、LDH降低，C、E组12 h和24 h的AST、LDH降低；与A组比较，B组24 h AST降低，C组24 h AST及12 h LDH降低，E组12、24 h AST和LDH降低；与B组比较，C、E组12 h AST、LDH降低；与同组6 h比较，C组24 h AST降低，12、24 h LDH降低；与同组12 h比较，B、C、E组24 h AST降低，C组24 h LDH降低。与d组比较，b组SOD、GSH-px、MMP、ATP降低，MDA、ROS升高(P均<0.05)；与b组比较，a组和c组SOD、GSH-px、MMP、ATP升高，MDA、ROS降低。说明葛黄颗粒含药血清对乙醇诱导的L-02细胞氧化应激反应具有明显的拮抗作用，能够降低细胞ROS的产生，提高肝细胞中抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化、保护生物膜，维持线粒体膜电位水平，促进细胞内ATP合成，减轻细胞内能量代谢障碍，改善线粒体的功能，从而有效减轻乙醇诱导的L-02细胞氧化应激损伤，是防治ALD的有效途径之一。

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ProtectiveeffectofGehuanggranulemedicatedserumonethanol-inducedinjuryofhumanhepatocytesL-02

RENDefang1,CHENYouling,LANGHan,FUYu,WANGHonglian,WEIMei,WANGXiaodong,LIZhi

(1IntegratedChineseandWesternMedicineCollegeofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo observe the effects of different dosages of Gehuang granule medicated serum (GHG) on the ethanol-induced injury of human hepatocytes L-02 and to explore its possible mechanism.Methods① L-02 cells were divided into groups A, B, C, D, E, and F. Except the group F, the other groups were cultured in ethanol for 24 h, and the medium was taken away after the model was established. The groups D and F were added with the blank serum (10% normal rat serum), the rest were added with the corresponding drug-containing serum: group A was added with 1.25% GHG+8.75% normal rat serum, group B was added with 2.5% GHG+7.5% normal rat serum, groups C was added with 5% GHG+5% normal rat serum, group E was added with 5% metatoxin medicated serum+5% normal rat serum and then we continued to culture the cells for 6, 12, and 24 h. The activities of aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase (LDH) in the supernatant of each group were compared. ② The L-02 cells were inoculated into 2×104cells/6-well plate, and then were divided into groups a, b, c, and d. In addition to the group d, the remaining groups were added with the ethanol modeling, after that, the medium was taken away. The groups b and d were added with the blank serum, group a was added with 5% GHG, group c was added with 5% metatoxin medicated serum and then we continued to culture the cells for 24 h. The levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-px), reactive oxygen species (ROS), mitochondrial membrane potential (MMP), and adenosine triphosphate (ATP) were compared.ResultsCompared with group F, AST and LDH increased at each time point in the group D; compared with group D, AST and LDH in the group B decreased at 24 h, AST and LDH decreased at 12 and 24 h in the groups C and E, respectively; compared with group A , 24-hour AST (24 h AST) decreased in the group B, 24 h AST and 12 h LDH decreased in the group C, while AST and LDH decreased at 12 and 24 h in the group E; compared with the group B, AST and LDH decreased at 12 h in the group C and E; compared with the same group at 6 h, the 24 h AST in the group C decreased and the LDH decreased at 12 and 24 h; compared with the same group at 12 h, AST decreased at 24 h in the groups B, C, and E, and the LDH decreased at 24 h, allP<0.05. Compared with the group d, the levels of SOD, GSH-px, MMP, and ATP decreased, and MDA and ROS increased in the serum of group b (allP<0.05). Compared with the group b, the levels of SOD, GSH-px, MMP, and ATP increased, and MDA and ROS decreased in the groups a and c (allP<0.05).ConclusionGHG has a protective effect on ethanol-induced L-02 cell injury by regulating the level of intracellular oxidative stress and protecting mitochondrial function.

Gehuang granules; ethanol; human hepatocytes; L-02 cells; oxidative damage; mitochondrial function

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.001

R89；R36；R39

A

1002-266X(2017)47-0001-04

四川省科技厅课题(2013SZ0148)；泸州市科技局课题(2013LZLY-J24)。

仁德芳(1991-)，女，硕士，住院医师，主要研究方向为中西医结合防治消化系统疾病。E-mail： 2426503594@qq.com

李志(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向为中西医结合防治消化系统疾病。E-mail： 724232536@qq.com

2017-03-13)