去甲肾上腺素对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-02增殖、凋亡的影响

施媛萍，罗光华，郑璐，魏江，于洋

(1苏州大学附属第三医院，江苏常州 213003；2常州市第一人民医院)

去甲肾上腺素对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-02增殖、凋亡的影响

施媛萍1,2，罗光华1,2，郑璐1,2，魏江1,2，于洋1,2

(1苏州大学附属第三医院，江苏常州 213003；2常州市第一人民医院)

目的观察去甲肾上腺素(NE)对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-02增殖、凋亡的影响。方法体外培养HepG2细胞和L-02细胞，分别加入不同浓度NE处理，继续培养，采用MTT法观察细胞增殖情况，HE染色和Annexin V-FITC/PI染色法观察细胞形态学变化，流式细胞术观察细胞凋亡情况。结果经0.1、1、10、50 μmol/L NE处理24、48 h，HepG2细胞OD值显著下降(P均<0.05)，L-02细胞OD值无明显变化。10 μmol/L NE作用于HepG2细胞可见典型的凋亡形态学改变，胞质收缩、深染，核染色质浓缩；L-02细胞在NE作用前后形态学均无明显改变。HepG2细胞加入10 μmol/L NE后部分细胞呈绿色(为早期凋亡表现)，加入50 μmol/L NE后部分细胞膜呈绿色，细胞核呈红色(为晚期凋亡表现)；L-02细胞均未显示有荧光。0.1、1、10 μmol/L NE作用于HepG2细胞24 h后，其凋亡率均显著高于对照组(0 μmol/L NE)，且呈剂量依赖关系(P均<0.05)；而上述浓度NE作用于L-02细胞24 h后，其凋亡率较对照组先增高后降低(P均<0.05)。结论NE可以抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡，而对L-02细胞增殖和凋亡没有影响，提示其在特定类型肝癌临床治疗中具有潜在价值。

去甲肾上腺素；人肝癌细胞HepG2；人正常肝细胞L-02；细胞增殖；细胞凋亡

在我国原发性肝癌的发病率、病死率分别占恶性肿瘤的第3位和第2位，由于其发展快、转移早、预后差、生存期短，故化疗仍然是中晚期肝癌治疗的主要手段[1,2]。诱导肿瘤细胞凋亡是多年来医学界一直关注的课题之一，寻找高效低毒的诱导肿瘤细胞凋亡的药物是重中之重。去甲肾上腺素(NE)是交感神经的神经递质，在机体内主要调节心血管和呼吸等内脏活动，也参与体温调节、免疫调节和应激反应等生理过程。近年来研究表明，NE与肝星状细胞及肿瘤细胞的增殖、凋亡有着密切联系。本研究观察了NE对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-02增殖、凋亡的影响，旨在为NE在肝癌治疗中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器 HepG2细胞和L-02细胞均购自中科院上海细胞库。RPMI1640培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，NE、MTT和二甲基亚砜(美国Sigma公司)，ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS试剂盒(美国Biouniquer公司)。EPICS XL流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)，酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 HepG2细胞和L-02细胞培养 HepG2细胞和L-02细胞均在标准条件下(5%CO2、37 ℃)用内含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)及链霉素(100 μg/mL)的RPMI1640培养基培养，每3天传代1次。

1.3 NE对HepG2细胞和L-02细胞增殖的影响观察 采用MTT法。HepG2细胞和L-02细胞(分别计为HepG2细胞组和L-02细胞组)分别接种于96孔培养板，每孔5×103个细胞，每孔体积100 μL，培养24 h后，吸弃上清，各加入含有不同浓度(0、0.1、1、10、50 μmol/L)NE的培养基200 μL，继续培养24、48 h。每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃继续孵育4 h，小心吸弃上清，每孔加入150 μL的二甲基亚砜，振荡10 min，在酶联免疫检测仪波长490 nm下检测每孔的OD值，以仅加细胞培养液孔作为空白孔调零，取各组OD值的均数表示细胞的增殖情况。

1.4 NE对HepG2细胞和L-02细胞形态学的影响观察 分别采用HE染色和Annexin V-FITC/PI染色法观察细胞形态学变化。①HE染色法：HepG2细胞和L-02细胞(分别计为HepG2细胞组和L-02细胞组)接种于6孔培养板中(孔中提前放入经预处理盖玻片)，细胞融合生长到50%～70%。在开始实验前，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次细胞(2 mL/孔)，再用无血清的RPMI1640洗1次(2 mL/孔)，然后加入含有0、10 μmol/L NE的培养基3 mL/孔，于37 ℃继续培养24 h。将铺有细胞的盖玻片浸入95%酒精固定15 min，进行常规细胞HE染色，观察胞质和细胞核的形态。②ANNEXIN V-FITC/PI染色法：HepG2和L-02细胞(分别计为HepG2细胞组和L-02细胞组)接种于6孔培养板中(每孔接种细胞数为1×105个，培养液为3 mL)，培养24 h后，用PBS洗细胞2次(2 mL/孔)，再用无血清的RPMI1640洗1次(2 mL/孔)，然后加入含有不同浓度(0、10、50 μmol/L)NE的培养基3 mL/孔，于37 ℃继续培养24 h。用PBS洗涤细胞1次，在500 μL Annexin V Binding Buffer中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide，混匀加入培养板中，避光、室温反应10 min，于荧光显微镜下观察。早期凋亡细胞Annexin V-FITC阳性呈绿色，晚期凋亡细胞Annexin V-FITC和Propidium Iodide均阳性，细胞膜呈绿色，细胞核呈红色。

1.5 NE对HepG2细胞和L-02细胞凋亡的影响观察 采用ANNEXIN V-FITC/PI染色法。HepG2细胞和L-02细胞(分别计为HepG2细胞组和L-02细胞组)接种于6孔培养板中(每孔接种细胞数为1×105个，培养液为3 mL)，培养24 h后，用PBS洗细胞2次(2 mL/孔)，再用无血清的RPMI1640洗1次(2 mL/孔)，然后加入含有不同浓度(0、0.1、1、10 μmol/L)NE的培养基3 mL/孔，于37 ℃继续培养24 h。0.25%胰酶消化细胞，用PBS洗涤细胞2次(离心2 000 r/min，5 min)，收集细胞，加入500 μL Annexin V Binding Buffer悬浮细胞，后加入5 μL Annexin V-FITC混匀，加入5 μL Propidium Iodide，混匀，避光、室温反应10 min，流式细胞仪检测凋亡率。以FITC和PI荧光信号作双参数散点图，将细胞分为4个区，分别为活细胞(Annexin V-FITC-/PI-)、早期凋亡细胞(Annexin V-FITC+/PI-)、机械损伤细胞(Annexin V-FITC-/PI+)和凋亡晚期或坏死细胞(Annexin V-FITC+/PI+)。凋亡细胞率=早期凋亡细胞数/总细胞数×100%。

2 结果

2.1 两组细胞增殖情况比较 结果见表1。由表1可知，经过NE处理24、48 h，HepG2细胞组OD值显著下降，且呈浓度依赖性(P均<0.05)；而L-02细胞组OD值无明显变化(P均>0.05)。

表1 NE处理24、48 h时两组细胞OD值比较

2.2 两组细胞形态学变化 ①HepG2细胞组加入0 μmol/L NE后细胞呈多角形致密单层贴壁生长，增殖旺盛；加入10 μmol/L NE后细胞可见典型的凋亡形态学改变，胞质收缩、深染，核染色质浓缩，聚集于核膜下呈境界分明的颗粒块状小体，细胞形态完整。L-02细胞组在NE作用前后形态学均无明显改变。②HepG2细胞组加入0 μmol/L NE后细胞大部分无荧光；加入10 μmol/L NE后部分细胞呈绿色(为早期凋亡表现)；加入50 μmol/L NE后部分细胞膜呈绿色，细胞核呈红色(为晚期凋亡表现)。L-02细胞组在各浓度NE作用前后形态学均无明显改变，细胞均未显示有荧光。

2.3 两组细胞凋亡情况比较 0.1、1、10 μmol/L NE作用于HepG2细胞组24 h后，其凋亡率分别为3.5%±0.4%、12.4%±3.2%、21.7%±6.2%，均高于0 μmol/L NE处理的凋亡率(0.9%±0.2%)，且呈剂量依赖性(P均<0.05)。0.1、1、10 μmol/L NE作用于L-02细胞组24 h后，其凋亡率分别为26.7%±1.6%、25.1%±1.1%、17.4%±1.1%，较0 μmol/L NE处理的凋亡率(21.2%±1.6%)先增高后降低(P均<0.05)。

3 讨论

原发性肝癌是指自肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌症，是常见的恶性肿瘤之一，病死率在消化系统恶性肿瘤中列第3位，仅次于胃癌和食管癌[3,4]。肝癌起病隐匿，早期缺乏典型症状，表现出明显症状的就诊者中约1/3已属晚期，亟需为其早期诊断筛查寻找新型有效的靶点[5～7]。研究[8～10]发现，肝癌的发病机理与细胞生长的异常调节相关，比如凋亡途径缺陷，Bcl-2、Survivin等抗凋亡蛋白上调，Caspase-3凋亡前体蛋白下调等。目前，绝大多数研究聚焦于药物对于肝癌细胞增殖及凋亡的作用，而对于其在正常肝细胞中所起的作用研究甚少。

NE是交感神经的神经递质，主要由去甲肾上腺素能神经末梢释放，也可由肾上腺髓质少量分泌。NE在机体内主要调节心血管和呼吸等内脏活动，也参与体温调节、免疫调节和应激反应等生理过程。细胞凋亡亦称程序性细胞死亡，是由细胞内外环境变化或死亡信号激发，并在基因调控下所引起的细胞主动死亡过程，也可通过药物或辐射等外因诱导。细胞凋亡是多种基因参与的过程，同时也是机体自身免疫调节的过程[11]。目前，国内外研究较多集中在NE诱导正常细胞的凋亡上，诸多体内外实验都证实了NE能诱导心肌细胞、肺泡上皮细胞凋亡[12～14]，并呈明显的时间和剂量依赖的关系，部分实验并对其机制进行了初步研究[15,16]。根据NE对心肌细胞和肺泡上皮细胞的作用机制，国外学者已经成功将NE应用于心衰和肺水肿等疾病的治疗，并取得较令人满意的结果。Mamani-Matsuda等[17]尝试用长效肾上腺素类药物福莫特罗和沙美特罗治疗B细胞性慢性粒细胞白血病(B-CLL)，结果证实不同浓度的福莫特罗和沙美特罗均可有效减少B-CLL细胞数量，并呈浓度依赖性，而对正常的人B细胞没有类似的作用。

本研究MTT结果显示，经0.1、1、10、50 μmol/L NE处理24、48 h，HepG2细胞OD值显著下降，L-02细胞OD值无明显变化。HE染色显示，10 μmol/L NE作用于HepG2细胞可见典型的凋亡形态学改变，胞质收缩、深染，核染色质浓缩；L-02细胞在各浓度NE作用前后形态学均无明显改变。Annexin V-FITC/PI染色形态学观察发现HepG2细胞加入10 μmol/L NE作用后部分细胞呈绿色(为早期凋亡表现)，加入50 μmol/L NE后部分细胞膜呈绿色，细胞核呈红色(为晚期凋亡表现)；L-02细胞均未显示有荧光。流式细胞术显示，0.1、1、10 μmol/L NE作用于HepG2细胞24 h后，其凋亡率均显著高于对照组(0 μmol/L NE)，且呈剂量依赖关系；而上述浓度NE作用于L-02细胞24 h后，其凋亡率较对照组(0 μmol/L NE)先增高后降低。由此可见，NE可抑制HepG2细胞增殖，并诱导其发生明显凋亡；而L-02细胞在低浓度NE的作用下无明显改变，在较高浓度NE的作用下反而凋亡下降。即NE在体外既能诱导肝癌细胞凋亡又能提高人正常肝细胞的活力，但具体机制不明，有待进一步实验探索。此结果与杨大鹏等[18]近期研究得出NE促进肝癌细胞增殖结果不同，但其使用的肝癌细胞株为Huh7和PLC，与本研究组不同。据美国模式菌种收集中心和中国科学院细胞库记载3株细胞的建株来源和特性均不同，其中HepG2细胞来源于15岁的白人男性肝癌患者，不携带乙肝病毒基因组；PLC细胞来源于人肝癌亚力山大细胞，分泌乙肝病毒表面抗原；Huh7来源于人男性肝癌细胞，分泌甲胎蛋白，胰酶α抗体等。这可为国际上提出的NE对于肿瘤作用的争论提供依据。2009年，Fitzgerald[19]提出假设NE是某些肿瘤的致病因素，通过降低NE水平或阻断其受体可预防肿瘤的发生；而2011年，Friedman等[20]通过流行病学调查研究得到的数据并不支持药物性阻断NE信号途径可以预防多种肿瘤的假设，由此推断NE对于肿瘤细胞的作用可能与其浓度及肿瘤的来源类型有关，NE在体外既能诱导肝癌细胞HepG2凋亡又不影响人正常肝细胞L-02的增殖凋亡，选择合适的剂量并应用于正确类型的肝癌是NE应用于肝癌治疗的关键。

总之，NE可以抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡，而对L-02细胞增殖和凋亡没有影响，拓展了NE在临床原发性肝癌治疗中的应用价值。我们将进一步探索NE与抗肝癌药物的协同抗肿瘤作用以及其抗肿瘤作用的深层机制，为原发性肝癌治疗提供新的实验依据和研究思路。

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EffectsofnorepinephrineonproliferationandapoptosisofhumanHepG2andL-02cellsinvitro

SHIYuanping1,LUOGuanghua,ZHENGLu,WEIJiang,YUYang

(1TheThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Changzhou213003,China)

ObjectiveTo observe the effects of norepinephrine (NE) on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and human normal liver cell line L-02.MethodsHepG2 and L-02 cells were cultured in vitro and were treated with different concentrations of NE. Cell proliferation and apoptosis were examined by MTT assay and flow cytometry, respectively. Cell morphology was observed by HE staining and Annexin V-FITC/PI staining.ResultsAfter treatment with 0.1, 1, 10, and 50 μmol/L NE for 24 and 48 h, the OD value of HepG2 cells decreased significantly (allP<0.05), while the OD value of L-02 cells had no significant change. HepG2 cells treated with 10 μmol/L NE showed obvious apoptotic morphology: there was contracted and stained cytoplasm, as well as condensed chromatin. L-02 cells had no significant changes in morphology before and after NE treatment. After adding 10 μmol/L NE to HepG2 cells, the cells showed a green color (early apoptosis). After addition of 50 μmol/L NE, some of the cells showed a green membrane and a red nucleus (which is a sign of late apoptosis). No fluorescence was observed in the L-02 cells. The apoptotic rates of HepG2 cells treated with 0.1, 1, and 10 μmol/L NE for 24 h were significantly higher than those of the control group (0 μmol/L NE) with a dose-dependent manner (allP<0.05). However, the apoptosis rate of L-02 cells treated with the above concentrations of NE for 24 h increased first and then decreased (allP<0.05).ConclusionNE inhibits the proliferation and induces apoptosis of HepG2 cells, but has no effect on the proliferation and apoptosis of L-02 cells, suggesting that it may have potential value in the clinical treatment of specific types of hepatic carcinoma.

norepinephrine; human hepatocellular carcinoma cell line HepG2; human normal liver cell line L-02; cell proliferation; apoptosis

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.002

R735.7

A

1002-266X(2017)47-0005-04

江苏省常州市国际科技合作项目(CZ20160013)；常州市卫生局指导性科技项目(WZ200901)；江苏省青年医学人才(QNRC2016282)。

施媛萍(1982-)，女，硕士，副研究员，主要研究方向为医学基础研究。E-mail: luhao64@163.com

罗光华(1972-)，男，博士，研究员，主要研究方向为医学基础研究。E-mail: shineroar@163.com

2017-09-10)