超低温冷冻对俄罗斯鲟精子形态结构的影响

黄晓荣，张 涛，冯广朋，赵 峰，刘鉴毅，王 妤，章龙珍，庄 平

（中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090）

超低温冷冻对俄罗斯鲟精子形态结构的影响

黄晓荣，张 涛，冯广朋，赵 峰，刘鉴毅，王 妤，章龙珍，庄 平

（中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090）

选取6 ind健康的雄性俄罗斯鲟（Acipenser gueldenstaedti），经人工催产后获得成熟的精子，运用扫描电镜和透射电镜，观察了超低温冷冻前后精子的形态结构。结果显示，经过超低温冷冻后精子形态结构发生了较大变化，其中冻精顶体长度、头中部宽度及中段宽度与鲜精相比显著增加（P＜0.05）；中段长度及后外侧延伸物与鲜精相比显著减少（P＜0.05）。冻后有38.6%的精子在形态结构上受到不同程度的损伤。精子的结构损伤主要表现在精子顶体不明显或与核发生糅合，后外侧延伸物消失，甚至顶体脱落；精子核膜皱褶，泡状化，膜与核之间空隙加大，有的部分甚至出现膜断裂，核内内切沟模糊；精子中段发生膨大和变形，线粒体外膜破损，线粒体条状嵴结构弥散，线粒体脱落；鞭毛外鳍褶与鞭毛脱离，鞭毛与中段脱离，少数鞭毛在中段断开。结果表明，超低温冷冻对精子的损伤主要集中在膜系统，中心粒等微管系统基本完好。

俄罗斯鲟；精子；超低温冷冻；超微结构；冷冻损伤

俄罗斯鲟（Acipenser gueldenstaedti）属鲟形目（Acipenseriformes），鲟科（Acipenseridae），鲟属，不仅肉味鲜美，营养丰富，还具有药用、美容、滋补功效，自古以来就被视为水中珍品［1］。近年来，由于过度捕捞、环境污染及水电工程建设等原因，鲟类资源量大幅度下降并处于濒危状态，已经被国际自然和资源保护联盟（IUCN）（1996）列为易危种，1997年世界濒危动物贸易公约组织（CITES）将其列为附录Ⅱ［2］。因此，亟需开展其精子的超低温冷冻保存研究工作。

在精子的超低温冷冻保存研究中不可避免地会造成其形态结构的损伤，而精子形态结构的完整与否又直接与精子活力相关，进而影响精子的受精能力［3］。检测精子超低温冷冻前后形态结构已被应用于大黄鱼（Pseudosciaena crocea）［4］、 点 带 石 斑 鱼 （Epinephelus malabaricus）［5］、真鲷（Pagrosomusmajor）［6］、虾夷扇 贝 （Patinopecten yessoensis）［7］、 长 牡 蛎（Crassostrea gigas）［3］等鱼、贝类精子质量评估中。本研究利用扫描电镜和透射电镜，分析了俄罗斯鲟精子超低温冷冻保存前后形态结构的变化，旨在了解超低温冷冻对精子的损伤机制，进一步改善精子超低温冷冻保存方法，以期对俄罗斯鲟种质资源的保护以及养殖俄罗斯鲟种质的改良起到参考作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源

实验用亲鱼来源于杭州千岛湖鲟龙科技开发有限公司千岛湖养殖基地，在网箱中进行养殖。2015年5月，在俄罗斯鲟的繁殖季节，选取年龄为7龄、体长 91.5～112.6 cm、体重 4.52～6.34 kg的雄鱼6 ind用于实验。

1.2 精子采集

雄鱼经人工催产后采集精子。待亲鱼麻醉后，用直径6 mm左右的聚丙烯塑料软管插入雄鱼生殖孔，轻轻挤压腹部，让精液流入塑料袋中，要求精液无血、无水、无粪便等污染，选取活力90%以上的鲜精5 mL，用等量2.5%的戊二醛固定，4℃保存以备进行电镜观察。

1.3 冻精制备

选取活力90%以上的鲜精5 mL，以10%的甲醇作为抗冻剂，以含23.4 mM蔗糖＋0.25 mM KCl＋30 mM Tris（pH 8.0）的混合溶液作为稀释液，将精液与预冷（4℃）的抗冻保护液按1∶1（V／V）混合后，装入250μL塑料离心管，液氮面1 cm处平衡1 min后，迅速投入－196℃的液氮中保存。解冻时，先将样品快速提至液氮面1 cm处平衡1 min，再取出样品于38℃水浴中解冻。冻精用等量的2.5%戊二醛固定，4℃保存以备进行电镜观察。

1.4 电镜观察

扫描电镜样品制备：将固定的精液用pH 7.4的磷酸缓冲液（PBS）清洗3次后，再用1%～2%锇酸固定1.5 h，经PBS清洗1次，各级酒精梯度脱水，醋酸异戊酯过渡，自然干燥后喷金，置于JEOL-6380 LV扫描电镜下观察。

透射电镜样品的制备：将固定的精液经3 000 r·min－1离心 5 min，弃上清液，再加等量 2.5%戊二醛。30 min后将沉淀从离心管中分离出来，再置于2.5%戊二醛中，4℃下保存备用。样品用pH 7.4的PBS液漂洗3次后，再用1%～2%锇酸固定，梯度酒精脱水，Epon 812树脂包埋，Ultracute超薄切片机切片，切片厚度为70～80 nm。样本经醋酸铀和柠檬酸铅染色后置于HITACHIH-600型透射电镜下观察并拍照。

1.5 测量及数据处理

扫描电镜下分别选取80个鲜精及冻后精子，测量其顶体长度、宽度、头长、中段长等9组数据。精子各个部位的测量按MARTIN等［8］对精子各部的划分和测量点，利用显微图像分析软件（Image-Pro Plus 5.1，Media Cybernetics，USA）进行测量。

在扫描电镜下随机选取80个冻后精子样本，统计受损精子数。用方差分析（ANOVA）检验组间差异是否显著。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。数据表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 精子数据测量

俄罗斯鲟精子经过超低温冷冻后，外部形态发生了较大变化。测量结果表明，经过冷冻后俄罗斯鲟精子顶体长度、头中部宽度、中段宽度等显著增加（P＜0.05）；中段长度缩短，后外侧衍生物变短，冻精与鲜精有显著差异（P＜0.05）；其它指标无显著性差异（P＞0.05）（表1）。

表1 俄罗斯鲟鲜精与冻后精子形态比较Tab.1 Dimension of fresh and frozen-thawed semen under scanning electron m icroscopy

2.2 精子超微结构观察

俄罗斯鲟精子分为顶体、细胞核、中段和尾部（图版Ⅰ-1，7）。总长为（49.05±1.58）μm（图版Ⅰ-1）。精子头部为细胞核，呈由前往后逐步变细的棒状，长度为（6.98±0.56）μm。紧接细胞核的是中段，中段为矩形，长和宽分别为（2.56±0.33）μm和（0.92±0.25）μm（图版Ⅰ-1，7）。中段后接鞭毛，鞭毛长度为（42.73±3.53）μm（图版Ⅰ-1）。

通过对俄罗斯鲟冻精的统计，有约38.6%的精子出现不同程度的损伤，其损伤情况和损伤部位主要集中在以下几个方面：

顶体俄罗斯鲟精子头部顶端有明显的顶体，呈帽状覆盖于精子顶端，长（0.64±0.089）μm，宽（0.86±0.099）μm（图版Ⅰ-2，5，7，9，11）。顶体由顶体泡和亚顶体组成，两者外都有膜包被，在顶体和亚顶体之间有顶体膜相隔（图版Ⅰ-9）。自顶体沿精细胞长轴方向可看到若干条后外侧延伸物（图版Ⅰ-2）。经过冷冻保存后，受损精子表现出顶体不明显或与核发生糅合，后外侧延伸物消失，甚至顶体脱落（图版Ⅰ-4，8，10）。

细胞核细胞核由染色较深的电子致密物组成，核质分布均匀，外周质膜覆盖，电镜下质膜显双线形结构，膜与核结合紧密，核中无囊泡（图版Ⅰ-7，8，9）。细胞核中有3条内切沟，始自植入窝，一直延伸至顶体（图版Ⅰ-7，8，9，11）。冷冻保存后，受损精子核膜皱褶，泡状化，膜与核之间空隙加大，有的部分甚至出现膜断裂，核内内切沟模糊（图版Ⅰ-4，8）。

中段俄罗斯鲟精子中段由中心粒复合体、线粒体以及伸入中段的轴丝等组成（图版Ⅰ-10）。在中段和细胞核连接处有向核内凹陷的植入窝和纤维体结构。在中段和细胞核连接处，细胞核向核内凹陷形成植入窝，植入窝由膜包被呈囊状结构，纤维体位于植入窝内（图版Ⅰ-7，8，10）。植入窝之后是近端中心粒与远端中心粒组成的中心粒复合体。线粒体为不规则的卵圆形，分1～2层排列，多分布在中段的前部，线粒体中可观察到长条形髓样嵴结构（图版Ⅰ-10，14）。细胞质鞘中也有线粒体分布（图版Ⅰ-10，13）。经过冷冻保存后，受损精子中段发生膨大，中段变形，部分中段直径大于核直径（图版Ⅰ-4，8），线粒体外膜破损，线粒体脱落（图版Ⅰ-3，4）；线粒体条状嵴结构弥散，线粒体间界限模糊（图版Ⅰ-13），中心粒，轴丝结构未发生明显变化（图版Ⅰ-10）。

鞭毛俄罗斯鲟精子鞭毛较长，为（42.73±3.53）μm（图版Ⅰ-1）。鞭毛两侧有侧鳍，侧鳍的基部分布着小的颗粒状物质，轴丝为典型的“9＋2”微管结构（图版Ⅰ-12，13），侧鳍所在平面与轴丝中央微管所在平面平行侧鳍宽度为（0.51±0.13）μm（图版Ⅰ-12）。侧鳍在接近尾部时逐渐变窄，轴丝直径也逐渐减小（图版Ⅰ-6）。冻后损伤主要表现在鞭毛外鳍褶与鞭毛脱离，鞭毛与中段脱离，少数鞭毛在中段断开（图版Ⅰ-3，4，6，7，8，9，10）。

3 讨论

3.1 超低温冷冻对精子活力的影响

超低温冷冻对精子膜系统的影响主要有两个方面：第一是膜结构损伤，在降温过程中精子会在细胞内形成冰晶，膜发生相变，膜脂晶格化，膜蛋白从膜上脱落，给精子细胞造成不可逆的损伤［9］。第二是生化损伤，在降温过程中细胞外水分首先结冰，导致细胞内水分向外流失，细胞脱水后体积变小，胞内离子浓度增加，大分子物质相互挤压，pH及酶活性都会发生变化［10－12］。这两种损伤从外观上均表现为质膜、核膜、线粒体膜、顶体膜、鞭毛外膜等膜结构囊泡化，顶体破坏，表面破损、断裂，内容物消散，线粒体嵴弥失。经过超低温冷冻后，有38.6%的俄罗斯鲟精子表现出不同程度的损伤，这可能是冷冻后精子活力下降的主要原因。

3.2 超低温冷冻对精子外部形态的影响

俄罗斯鲟精子的形态与大多数硬骨鱼类精子的形态有很大的差别。大多数硬骨鱼类的精子头部呈圆形，核前方无顶体［13－18］，只是极少数鱼如圆斑星鲽（Verasper variegates），在精子核前区有凹陷的特殊结构，这种特殊的结构被认为是顶体的遗迹［19］。俄罗斯鲟精子顶体为帽状，有后外侧 延 长 物 （PLP），除 施 氏 鲟 （Acipenser schrenckii）外，西伯利亚鲟（Acipenser baerii）等 9种鲟类顶体均有后外侧延伸物［20］，DILAURO等［21－24］认为PLP在授精过程中可以锚住卵子。精子的顶体结构和明显的中段是鲟鱼类这种古老鱼类精子的特征［20］。经过超低温冷冻后，部分俄罗斯鲟精子的顶体前端延伸成一个棒状结构，受损不明显的精子顶体长度增大。冷冻前精子样本中未见这种现象，分析认为是精子顶体内容物排出所致。在哺乳动物中也有类似的现象，有学者认为这是精子过早发生获能和顶体反应，精子难以穿过卵膜完成受精［25－26］。有关鲟精子顶体反应过程及精卵结合后精子结构变化还有待更深入研究。

3.3 超低温冷冻对精子内部结构的影响

冷冻前的精子细胞核由均一的电子致密物质组成，但冷冻后部分核内出现了空泡结构，精子核中段明显增粗。这种空泡结构与某些硬骨鱼类中的核泡较为相似，但硬骨鱼中核泡是将与遗传信息无直接关系的物质如非组蛋白和RNA等通过外排作用从核中排出而形成的，且核泡随着精子成熟不断减少［27］。俄罗斯鲟精子细胞核中空泡的形成发生在冷冻后，它是否也存在如硬骨鱼核泡那样的外排作用还不得而知。精子核中段的增粗可能是由于膜泡状化及膜破裂后外源物质进入核内造成的。精子中段是游动型精子的能量来源，俄罗斯鲟精子中段为矩形，比一般硬骨鱼类长，可以容纳的线粒体较多［17］。线粒体是精子能量贮存场所，给激活后的精子提供运动能量。本研究发现，经过超低温冷冻后，部分俄罗斯鲟精子线粒体膜破损，线粒体嵴弥散，线粒体脱落。这与王小刚等［5］对点带石斑鱼（Epinephelus coioides）精子的研究结果一致。线粒体结构的损伤会影响精子获能，导致精子活力及授精能力下降，甚至死亡。

鞭毛是精子的运动器官，精子激活后的运动是依靠尾部鞭毛的摆动来实现。研究表明，超低温冷冻基本不会对精子微管系统的结构造成明显损伤［28］。本研究发现，俄罗斯鲟精子远端中心粒（基体）是由9组三联微管组成，鞭毛为典型的“9＋2”结构［29］，精子鞭毛和中段的连接部位有部分精子发生断裂现象。章龙珍等［27］研究认为，精子鞭毛与中段结合处是精子由远端中心粒到鞭毛的过渡，是两种不同的细胞骨架结构连接处，也是相对较为脆弱的地方，这些部位只有脆弱的膜结构，缺少骨架结构支撑，在超低温冷冻中容易受到冷冻损伤，造成不同程度的脱落、断裂等现象。林丹军等［30］对大黄鱼（Larimichthys crocea）精子的研究则认为，该现象可能是精子在冷冻和解冻过程中头部质膜和尾部质膜肿大，导致轴丝断裂，断裂的轴丝又发生移位的缘故。因此，冷冻复温后精子活力下降与鞭毛结构的破损密切相关。

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Effects of cryopreservation on morphology and ultrastructure of Acipenser gueldenstaedti spermatozoa

HUANG Xiao-rong，ZHANG Tao，FENG Guang-peng，ZHAO Feng，LIU Jian-yi，WANG Yu，ZHANG Long-zhen，ZHUANG Ping
（Key Laboratory of East China Sea＆Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Science，Shanghai 200090，China）

To deeply understand the effects of cryopreservation on the configuration of spermatozoa，we chose Acipenser gueldenstaedti as the object，and observed the exterior shapes and interior structure of spermatozoa bymeans of scanning electron microscope and transmission electron microscope.

The adults of Acipenser gueldenstaedti were collected from Qiandao Lake，Zhejiang Province，China，the maleswere aged 7.The average length was 91.5－112.6 cm and average weight was 4.52－6.34 kg.Six mature males were selected to extract uncontaminated spermatozoa from abdomen.Sperm motility was estimated using amicroscope，sampleswith above 90%ofmotile spermatozoa were used to study.

Native semenswere diluted 1∶1 with 23.4 mM sucrose＋0.25 mM KCl＋30 mM Tris（pH 8.0）and addition 10%glycol as cryoprotectants，the sampleswere plunged in 250μL plastic centrifuge tube，samples were equilibrated for 20 min at 4℃，then equilibrated for 1 min at－20℃，and preserved in liquid nitrogen，the samples were thawed in 38℃ bath before determination.Fresh and frozen spermatozoa were fixed with 2.5%glutaraldehyde，then the sampleswere observed by electron microscope.

The sperm morphology and ultrastructure changed greatly after cryopreservation.The length of acrosome，the width of middle head and midpiece increased significantly（P＜0.05），the length of midpiece and posterolateral projections became shorter，there were significant differences between fresh and thawed sperm（P＜0.05）.About38.6%of the spermswere damaged after cryopreservation.The ultrastructure exhibition of cryodamage focused on the following aspects：the acrosome was not obvious or the acrosome mixed with nuclear，the posterolateral projections disappeared even the acrosome lost.The nuclear membrane of sperm folded and vacuolated，the gap between themembrane and the nucleus increased，membranes broke in some parts and interweaving endonuclear canals was unclear.The midpiece of sperm enlarged and deformed，mitochondrial outer membrane broke，mitochondrial stripe ridge structure dispersed and even mitochondria dropped，posterolateral fin of flagellum released from flagellum，the flagellum detached from midpiece，a few flagellaswere disconnected in themiddle.

Acipenser gueldenstaedti；spermatozoa；cryopreservation；ultrastructure；cryodamage

图版Ⅰ 冷冻前后精子形态结构PlateⅠ Shape and structure of spermatozoa before and after cryopreservation

S 917

A

1004－2490（2017）06－0640－09

2017－06－13

公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203065）；国家科技基础条件平台项目

黄晓荣（1978－），女，博士，副研究员，从事鱼类生理及低温生物学研究。E-mail：hxr828＠126.com

庄 平，研究员。E-mail：pzhuang＠ecsf.ac.cn