Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

刘锐锐，李聪慧，虞 游，陈建明

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

刘锐锐，李聪慧，虞 游，陈建明

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

为构建可在人肝癌细胞中稳定表达Egr-1基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体，设计合成Egr-1基因shRNA片段，连接到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pGreenPuroTMshRNA真核表达载体中，连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性菌落扩大培养，经菌液PCR法初步鉴定为pGreenPuro-Egr-1 shRNA重组子的重组子DNA，用测序法进一步鉴定，结果显示成功构建了Egr-1基因shRNA的反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1 shRNA.

Egr-1基因；shRNA；反义干扰；载体构建

0 引言

前期研究发现，姜黄素能通过诱导早期生长反应因子1(Early growth response factor 1)基因Egr-1表达而抑制肝癌细胞HepG-2增殖[1]，且Egr-1基因外来过表达也能抑制HepG-2细胞增殖[2]，提示Egr-1基因可能参与姜黄素抑制肝癌细胞HepG-2的增殖作用.姜黄素是一种天然抗氧化剂，能抑制多种肿瘤细胞增殖并能诱导肿瘤细胞发生凋亡[3-5].虽然有报道发现姜黄素抑制肿瘤细胞增殖可能与细胞周期阻滞有关[6-7]，而诱导肿瘤细胞凋亡可能与多信号通路的相互作用有关[8]，但具体分子机制尚未清楚.Egr-1基因编码产物是一种早期生长反应因子，当细胞受到刺激之后Egr-1基因能够在短时间内迅速被激活而表达，从而直接或间接地调控一系列下游基因的表达[9-10].现已知Egr-1基因能被多种刺激源包括抗癌药物所激活，激活后的Egr-1基因产物可能参与细胞增殖及细胞凋亡等过程[11-12].本文利用RNAi Designer设计Egr-1 基因siRNA序列，并根据pGreenPuroTMshRNA表达载体的要求设计合成Egr-1基因shRNA序列，构建Egr-1基因反义干扰表达载体，为深入研究Egr-1基因参与姜黄素抑制HepG-2细胞增殖作用的机制奠定基础.

1 材料和方法

1.1 主要仪器

My Gene PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司)，Tanon Gis System凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)，电热恒温水槽、电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，小型台式冷冻式离心机、分光光度计(Eppendorf)，电泳仪(Amersham Biosciences).

1.2 主要试剂

PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)，质粒提取试剂盒(Biomiga)，琼脂糖(Biowest)，DNA marker(Takara)，BamHⅠ、EcoRⅠ(Thermo Scientific)，T4连接酶、X-gal及IPTG(碧云天生物技术研究所)，氨苄青霉素(北京全式金生物技术有限公司).

1.3 质粒、菌种

大肠杆菌DH 5α 感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，pGreenPuroTM克隆表达载体由浙江大学医学院提供.

1.4 Egr-1基因shRNA的设计合成

利用RNAi Designer(http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/frontpage.jsp)设计Egr-1 siRNA序列(5’-GATGAACGCAAGAGGCATA-3’).根据pGreenPuroTMshRNA表达载体的要求，首先在Egr-1基因siRNA序列的5’-端加上BamHⅠ酶切位点，随后在其3’-端加上Loop环序列TTCAAGAGA，接下来再加上其反向互补序列TATGCCTCTTGCGTTCATC，最后加上转录终止子序列TTTTT及EcoRⅠ酶切位点，此为Egr-1基因shRNA的正义链序列(5’-GATCCGATGAACGCAAGAGGCATATTCAAGAGATATGCCTCTTGCGTTCATCTTTTTG).再按同样方法设计Egr-1基因shRNA的反义链序列(5’-GCTACTTGCGTTCTCCGTATAAGTTCTCTATACGGAGAACGCAAGTAGAAA AACTTAA).将设计好的Egr-1基因shRNA的正义链及反义链交由上海生工合成.

1.5 Egr-1基因shRNA反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1 shRNA的构建

将合成好的Egr-1基因shRNA的正义链和反义链退火成双链DNA.pGreenPuroTMshRNA载体经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，凝胶电泳纯化回收目的酶切产物.按照pGreenPuroTMshRNA表达载体构建要求，将双链Egr-1基因shRNA和pGreenPuroTMshRNA载体酶切产物在T4连接酶的作用下，于16 ℃连接过夜，将连接产物转化到DH 5α 感受态大肠杆菌中并涂到含有氨苄的筛选培养板上.挑取若干阳性菌落，摇菌扩大培养并用菌液PCR进行初步筛选.

1.6 pGreenPuro-Egr-1 shRNA表达载体的鉴定

以P-F和P-R为引物，用菌液PCR进行初步筛选.PCR反应体系(20 μL)：2×PCR Master 10 μL；P-F(10 μmol/L)1 μL；P-R(10 μmol/L)1 μL；菌液1 μL；加灭菌水至20 μL.载体鉴定引物P-F：5’-AATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’；P-R：5’-TGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTA-3’.反应条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环18次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.以ddH2O和pGreenPuroTMshRNA空载体为对照，2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统成像拍照.连入正确目的片段阳性菌落的PCR产物应为154 bp，未连入目的片段的空载体可产生105 bp的PCR产物.对PCR鉴定正确的菌液进行质粒提取并交由上海生工测序.

2 结果

2.1 pGreenPuro-Egr-1 shRNA反义干扰表达载体构建策略

设计合成好的Egr-1基因shRNA，与经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGreenPuroTMshRNA载体，用T4连接酶连接，16 ℃过夜，构建pGreenPuro-Egr-1 shRNA反义干扰表达载体，图1所示为构建策略.

图中上方显示的BamH I与EcoR I酶切位点之间的DNA序列为Egr-1基因shRNA序列.图1 pGreenPuro-Egr-1 shRNA反义干扰表达载体构建策略图Fig. 1 The schematic diagram of the construction strategy for pGreenPuro-Egr-1 shRNA antisense interfering expression vector

2.2 pGreenPuro-Egr-1 shRNA重组子PCR筛选鉴定

M：DNA 分子量标记；泳道1：ddH2O；泳道2：pGreenPuro shRNA空载体；泳道3～8：含pGreenPuro-Egr-1 shRNA 重组子的阳性菌落.图 2 pGreenPuro-Egr-1 shRNA重组子PCR鉴定结果Fig. 2 The identification result of pGreenPuro-Egr-1 shRNA recombinant vector with the PCR method

按上述构建策略将Egr-1 shRNA片段与pGreenPuroTMshRNA载体连接后的连接产物，转化DH5α菌后培养过夜，挑取几个抗性菌落扩大培养并用菌液PCR法进行筛选.含有Egr-1基因shRNA片段插入的pGreenPuro-Egr-1 shRNA目的重组子PCR扩增产物为154 bp，而pGreenPuroTMshRNA空载体PCR扩增产物为105 bp，PCR筛选鉴定结果(图2)显示泳道3～8的阳性克隆中含有目的重组子DNA.

2.3 pGreenPuro-Egr-1 shRNA重组子测序鉴定

对经PCR筛选鉴定结果含有目的重组子pGreenPuro-Egr-1 shRNA的阳性克隆进行质粒提取，将提取后的质粒DNA送予上海生工生物工程有限公司进行DNA测序鉴定.测序结果(图3)显示目的重组子中插入片段的DNA序列与设计合成的Egr-1 基因shRNA序列一致，说明Egr-1基因shRNA反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1 shRNA构建成功.

第28到第79之间的碱基序列即为Egr-1基因shRNA序列(见图1).图 3 目的重组子pGreenPuro-Egr-1 shRNA质粒DNA测序鉴定结果Fig. 3 The sequencing result of the desired recombinant pGreenPuro-Egr-1 shRNA plasmid DNA

3 讨论

肝癌等恶性肿瘤的传统治疗方法主要包括手术、放疗和化疗3种，但疗效并不理想且毒副作用大.因此，近年来兴起的综合疗法倍受关注，以保健品治疗肿瘤就是其中的一种方法.姜黄素是具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤作用的一种化合物，多项研究报道称，姜黄素处理后可使一系列基因的表达发生变化，例如p53、Bcl-2、BAX[3,5]等.Egr-1是一种核转录因子，属于Cys2His2型锌指结构EGR蛋白(Early growth response proteins)家族中的一员，其编码的蛋白质有3个重复的锌指结构域，可调控细胞增殖和细胞凋亡.长期以来Egr-1就作为一种肿瘤抑制因子存在，近年来的研究报道[13-15]已经证实，Egr-1基因可抑制乳腺癌、胃癌、肺癌细胞的生长.

本课题组的前期研究[1-2]发现，Egr-1基因在HepG-2细胞内处于低表达状态，姜黄素处理后能诱导其表达升高并能抑制HepG-2细胞增殖，而Egr-1基因的外来表达能抑制HepG-2细胞增殖，提示Egr-1基因可能在HepG-2细胞中起增殖抑制作用.本文构建了Egr-1基因shRNA的表达载体pGreenPuro-Egr-1 shRNA，该载体在细胞内能转录表达出Egr-1基因的小干扰性RNA，能特异性靶向沉默细胞内源性Egr-1基因.利用该载体，可以在后续研究中通过转染筛选，建立稳定的细胞内源性Egr-1基因靶向沉默的HepG-2细胞系，在内源性Egr-1基因靶向沉默状态下研究姜黄素处理对HepG-2细胞增殖及凋亡等的影响，为进一步研究Egr-1基因在姜黄素抑制HepG-2细胞增殖中的作用奠定基础.

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TheConstructionandIdentificationofEgr-1GeneAntisenceInterferingExpressionVector

LIU Ruirui, LI Conghui, YU You, CHEN Jianming

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

To construct the vector stably expressingEgr-1 shRNA in human hepatic carcinoma cells, the well designed and correctly synthesizedEgr-1 shRNA oligonucleotides were used to ligate into pGreenPuroTMshRNA eukaryotic expressing vector predigested withBamHⅠandEcoRⅠenzymes. The ligation product was then used to transform theE.coliand several positive colonies were picked out for further culture. And subsequently the positive colonies were checked with bacteria liquid PCR method to identify the pGreenPuro-Egr-1 shRNA DNA recombinant. The PCR preliminary identified DNA recombinant was further checked with DNA sequencing method. And finally, the sequencing results showed theEgr-1 shRNA recombinant expression vector termed pGreenPuro-Egr-1 shRNA was successfully and correctly constructed.

Egr-1 gene; shRNA; antisense interference; vector construction

2017-04-17

杭州市社会发展自主申报项目(20160533B01).

陈建明(1964—)，男，副教授，博士，主要从事肿瘤细胞分子生物学研究.E-mail：jianmingchen@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.06.009

Q253；R363.1

A

1674-232X(2017)06-0618-05