丙泊酚对大鼠初级躯体感觉皮层神经元电压门控钾通道的影响

何炯策,张宇,刘兴奎,喻田,黄千瑜

(1.温州医科大学附属第二医院 麻醉与围术期医学科,浙江 温州 325027;2.遵义医学院 麻醉学系,贵州 遵义 563003)

丙泊酚对大鼠初级躯体感觉皮层神经元电压门控钾通道的影响

何炯策1,张宇2,刘兴奎2,喻田2,黄千瑜1

(1.温州医科大学附属第二医院 麻醉与围术期医学科,浙江 温州 325027;2.遵义医学院 麻醉学系,贵州 遵义 563003)

目的:探讨丙泊酚对大鼠S1区神经元电压门控钾通道的影响.方法:使用全细胞记录脑片膜片钳技术测定神经元细胞外向钾电流.人工脑脊液中灌流不同浓度(10、30、100、300 μmol/L)丙泊酚,记录各组瞬间外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK),绘制外向钾通道电流电压(IV)曲线、稳态激活曲线并计算相关参数.结果:丙泊酚呈浓度依赖性抑制大鼠S1区神经元电压门控性IA,延缓瞬间外向钾通道的激活,使稳态激活曲线向去极化方向移动.同时丙泊酚呈浓度依赖性抑制大鼠S1区神经元电压门控性IK,但不影响延迟整流钾通道的激活.结论:丙泊酚对大鼠丘脑皮层环路中的S1区神经元电压门控钾通道的抑制作用可能是其诱导的全麻作用的机制之一.

丙泊酚;大鼠;膜片钳;钾通道

丙泊酚(propofol)目前被广泛应用于各年龄段患者手术的麻醉,以及包括人流、宫腔镜、无痛取卵、胃肠镜等在内的门诊短小手术及检查,其作用特点是快速、强效,维持时间短,可用于靶控输注,苏醒迅速、平稳、舒适[1].丙泊酚药物效应的确切机制尚不明确,主流的观点认为丙泊酚与中枢神经系统中GABA能神经传递的增强相关,表现为兴奋性传导的减弱及突触抑制的上调[2],同时与神经元细胞膜上的电压门控离子通道关系密切.前期研究证实丙泊酚呈剂量相关性影响大鼠初级躯体感觉皮层(S1)区神经元电压门控钠通道及动作电位(action potential,AP)的阈值、超射值[3],而丙泊酚是否会影响神经元钾电流的外流,该作用是否协同其对钠通道的抑制从而影响AP的产生和传播仍不明确.本研究使用全细胞记录脑片膜片钳技术,进一步评估丙泊酚与S1区神经元电压门控钾通道之间的药物效应.

1 材料和方法

1.1 材料 SPF级SD大鼠36只,雌雄不限,7~14日龄,购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所医学实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(渝)2007-0005.丙泊酚(1%,意大利阿斯利康公司),人工脑脊液(artificial cerebro-spinal fluid,ACSF):NaCl 126 mmol/L,CaCl22 mmol/L,KCl 2.5 mmol/L, MgSO4.7H2O 2 mmol/L, NaHCO325 mmol/L,NaH2PO4.2H2O 1.5 mmol/L,Glucose.H2O 10 mmol/L;电极内液:KCl 120 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,CaCl21 mmol/L,MgCl2.6H2O 2 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,Na2-ATP 3 mmol/L;细胞外液:NaCl 126 mmol/L,CaCl22 mmol/L,KCl l2.5 mmol/L,MgSO4.7H2O 2 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,NaH2PO4.2H2O 1.5 mmol/L, Glucose.H2O 10 mmol/L, TTX 0.001 mmol/L,pH值7.35~7.45. BX51W1-IR7显微镜, HM 650V全自动切片机,P-97微电极拉制仪,EPC10膜片钳放大器等.

1.2 方法

1.2.1 分组:分为对照组(Control组)及实验组,Control组灌流普通ACSF,实验组分为:Pro10组(ACSF中灌流丙泊酚10 μmol/L),Pro30组(30 μmol/L),Pro100组(100 μmol/L)及Pro300组(300 μmol/L),每组8例.

1.2.2 脑片的制备:参照课题组相关文献[5].

1.3 统计学处理方法 采用PatchMaster、Fit-Master、SPSS、Origin进行数据记录、提取、统计学分析及图表绘制,数据均用±s表示.2组间比较用LSD检验,多组间比较采用单因素方差分析.钾通道稳态激活曲线绘制,半数激活电压(V1/2)及曲线斜率因子(κ)的具体计算方法参照文献[4].P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 S1区神经元外向钾电流 钳制膜电位为-80 mV时,神经细胞去极化时主要激活瞬时外向钾电流(transient outward potassium currents,IA)及延迟整流钾电流(delayed rectifier potassium current,IK)2种钾电流成分,见图1A.钳制膜电位设定为-40 mV,细胞外向电流仅包含IK,见图1B.IA迅速激活并失活,IK缓慢激活并不失活,根据2类不同电流成分的电活性特征,记录图1A红箭头所示电流峰值为IA,记录图1B红箭头所示的电流值为IK(155 ms).

图1 S1区神经元钳制膜电位为-80 mV及-40 mV时的外向钾电流图

2.2 丙泊酚与IA、IV曲线 待细胞破膜稳定后施加脉冲刺激方波,记录各组电流曲线,见图2.分别以不同膜电位及所对应的IA值为坐标轴,绘制瞬间外向钾通道电流电压(current-voltage,IV)曲线.与Control组比,其他各组IA的激活阈电位未发生明显改变(-50 mV),IV曲线随着丙泊酚浓度的上升呈显著性下移,见图3.4组实验组以膜电位为+90 mV时的IA值为峰值,并以Control组为基准计算抑制率[抑制率=(Control组IA峰值-不同实验组IA峰值)/Control组IA峰值],IA峰值抑制率呈浓度依赖性上升,见图4.

2.3 丙泊酚对IA激活的影响 脉冲刺激方波待细胞稳定后施加刺激,记录各组电流曲线,见图5.所得IA值使用公式G=I/(V-Vrev)进行电导值计算,并以最大值为基准进行比值转换.根据伯尔兹曼方程分别拟合出Control组和Pro100组IA的稳态激活曲线,见图6,同时计算V1/2及κ.与Control组比,Pro100组曲线向右下方移位,V1/2显著增大(P<0.01),但2组κ值未发生明显变化(P>0.05),见表1.

2.4 丙泊酚与IK、IV曲线 脉冲刺激方波待细胞稳定后施加刺激,记录Control组和4组实验组电流曲线,绘制延迟整流钾通道IV曲线,见图7.与Control组比,4组实验组IK的激活阈电位未发生明显变化(-30 mV),IV曲线随着丙泊酚浓度的上升呈显著性下移,见图8.4组实验组以膜电位为+90 mV时的IK值为峰值,并以对照组为基准计算抑制率,结果显示IK值抑制率呈浓度依赖性上升,见图9.

图2 IA的刺激方波和电流曲线图

图3 Control组及各实验组IA电压曲线图

图4 4组实验组IA峰值抑制率图

图5 IA激活的刺激方波和电流曲线图

图6 Control组与Pro100组IA稳态激活曲线图

2.5 丙泊酚对IK激活的影响 脉冲刺激方波待细胞稳定后施加刺激,记录各组电流曲线,见图10.所得IK值使用公式G=I/(V-Vrev)及伯尔兹曼方程分别拟合出Control组和Pro100组IK的稳态激活曲线,见图11.同时计算V1/2及κ.丙泊酚并不显著影响IK激活过程,与Control组比较,Pro100组曲线未发生明显移位,2组V1/2及κ差异无统计学意义(P>0.05),见表2.

表1 IA的V1/2和κ值(n=8,

表1 IA的V1/2和κ值(n=8,

与Control组比:aP<0.01

组别 激活V1/2 κ Control组 -26.70±3.51 27.23±2.52 Pro100组 -17.03±2.03a 24.99±1.42

3 讨论

意识的产生和维持依赖于皮层、丘脑、中脑等多脑区的共同参与.全身麻醉效应引起的意识消失是由于药物作用使得大脑中各脑区的联系中断,而这种中断可能是信息内容的改变,包括电活动的频率、时程的改变,或者部分缺失导致信息的碎片化.它可以发生在脑区信息传导的单个环节或者信息转导的整合过程.

图8 Control组及各实验组IK电压曲线图

图9 4组实验组IK值抑制率图

图10 IK激活的刺激方波和电流曲线图

图11 Control组与Pro100组IK稳态激活曲线图

表2 IK的V1/2和κ值(n=8

表2 IK的V1/2和κ值(n=8

组别 激活V1/2 κ Control 5.89±0.84 14.97±1.12 Pro100 4.45±1.41 14.81±1.17

神经元的电活动是生物对外界信息处理、加工和传递的基本形式,离子通道则是电活动产生的基础.研究证实丙泊酚呈浓度相关性抑制S1区神经元电压门控钠通道并影响AP的相关参数.该抑制效应是通过改变通道电导及通道动力学特性实现的[3].钾通道在AP的产生中同样扮演着重要的角色,其活性决定AP产生的频率和形态,并与神经元突触连接的强度和信号整合密切相关[5].IA参与调节AP早期复极化,任何影响该通道电导和开放的因素都可以使细胞去极化的速度变慢,最终影响AP的发放.IK是AP复极化时中后期的主要成分[6],其幅度直接影响AP时程、幅度和频率,是细胞兴奋性和传导性的关键影响因素.本研究结果显示,丙泊酚对钾通道存在直接的抑制作用,该效应是通过IA及IK所共同介导的.一方面丙泊酚呈浓度相关性抑制IA的外流,减缓IA的激活过程,使曲线往去极化方向移位,但该过程中反映曲线变化速率的κ没有发生明显变化,因此瞬时外向钾通道是丙泊酚作用的可能位点之一.丙泊酚通过改变通道电导及激活过程,引发AP早期电压依赖性钾通道的开放延迟,从而减慢AP的生成,降低发放频率.另一方面大鼠S1区神经元IK的外流由于丙泊酚存在而受到抑制,该效应和丙泊酚存在浓度相关性.对IK通道动力学上的实验结果显示,丙泊酚不改变IK的激活过程,V1/2及κ的改变不明显.丙泊酚延长AP时程及有效不应期同时降低神经冲动发放频率是通过影响AP产生的电压门控钠、钾离子通道来实现,并可能进一步影响神经元细胞对传入信号的整合作用.丙泊酚对其他脑区也存在类似效应,JONES等[7]报道丙泊酚能抑制SD大鼠海马CA1区神经元由电流激发的动作电位和自发性动作电位.

生物体内的信息传递依靠神经细胞之间的电信号传导,意识的产生依赖于以神经细胞为基础的中枢神经系统的整体运作.ANDRADA等[8]的研究显示,丙泊酚对皮层、丘脑、网状结构具有类似的药物效应,它能减少神经元自发AP的发放,引起脑电图的改变,可能导致了最终的意识消失,但3者之间如何共同作用仍不清楚.离子通道及AP的改变可能以神经元电活动的形式通过各级的传入、传出神经纤维被无限放大,进一步影响相关脑区的联系,发挥广泛的中枢抑制作用,最终抑制或阻断中枢系统的信息整合导致意识的消失.丙泊酚对大鼠丘脑皮层环路中的S1区神经元电压门控钾通道的抑制作用是其诱导的全麻作用的可能机制之一.

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(本文编辑:吴彬)

Effects of propofol on potassium channels of S1 neurons in rats

HE Jiongce1, ZHANG Yu2, LIU Xingkui2,YU Tian2, HUANG Qianyu1.
1.Department of Anesthesia and Perioperative Medicine, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Anaesthesiology, Zunyi Medical College, Zunyi, 563003

Objective:To explore the effects of propofol on voltage-gated potassium channels of primary S1 neurons in rats.Methods:Whole-cell patch clamp technique was used to record potassium currents of neurons.After application with propofol at different concentrations (10-300 μmol/L) in ACSF, the currents of outward potassium currents (IA) and delayed rectifier potassium currents (IK) were recorded to make current-voltage curve,steady-state activation curve and account characteristic parameters.Results:Propofol inhibited IA of S1 neurons in rats in a dose-dependent manner. It also inhibited the activation of IA, shifted the activation curve towards the deperpolarzating potential. Propofol inhibited IK of S1 neurons of rats in a dose-dependent manner. But it did not affect activation of IK.Conclusion:The results of this study provide new vidence that propofol shows an inhibitory effect on voltage-gated potassium channels in the thalamocortical circuit, which may play a role in the mechanisms of propofol-induced general anesthesia.

propofol; rats; patch clamp; potassium channel

R614.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.003

2017-02-20

国家自然科学基金资助项目(81060266).

何炯策(1986-),男,浙江温州人,住院医生,硕士.