观察参麦对脓毒症患者外周血淋巴细胞抗凋亡因子Bcl—2及促凋亡因子caspase—3的影响

陈伟　谢敏　李燚　吴莹辉　郑承铎　高艺萍　林淑萍　庄菁

【摘要】 目的：探讨研究参麦注射液治疗脓毒血症患者的临床效果。方法：选择2015年12月-2016年12月于笔者所在医院接受治疗的80例脓毒血症患者作为研究对象，采用随机数字抽取表法将80例患者分为对照组（40例）和试验组（40例），其中对于对照组患者依据脓毒症指南给予标准治疗，试验组患者在对照组治疗基础上选用参麦注射治疗，对两组患者的外周血淋巴细胞中抗凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子caspase-3含量及5、28 d全因死亡率等进行比较。结果：经过治疗后，虽然试验组患者Bcl-2表达水平高于对照组组，且caspase-3含量低于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05）。试验组患者5 d全因死亡率为10.0%，28 d全因死亡率为25.0%，对照组患者5 d全因死亡率为12.5%，28 d全因死亡率为25.0%，数据比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：暂未发现参麦注射液可以有效影响Bcl-2、caspase-3及5、28 d全因死亡率，且对临床症状的改善效果不明显。

【关键词】 脓毒症； 凋亡； 系统性炎症反应综合征； 补偿性抗炎症反应综合征； 参麦

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.20.077 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）20-0149-05

脓毒症死亡率约30%，严重脓毒症死亡率高达50%，脓毒性休克死亡率约80%[1]，发展中国家每年有0.2‰～0.3‰人罹患脓毒症，美国每年约100万人感染脓毒症[1-2]。已有临床及实验室证据证明升高抗凋亡相关因子，如Bcl-2及降低促凋亡因子caspase-3可提高脓毒症试验动物的生存率，而参麦有效成分可升高Bcl-2及降低caspase-3，故本课題以脓毒症患者为研究对象，分别设立脓毒血症参麦干预组、脓毒血症对照组，用酶联免疫法检测不同时间段各组患者外周血淋巴细胞中抗凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子caspase-3含量，通过以上不同的方法在时间和空间上探脓毒血症白细胞凋亡的发生、发展规律和演变过程，以及使用参麦调控后的变化现象，了解凋亡现象在脓毒血症发病过程中所起的作用及其与白细胞凋亡的关系，应用其规律及时给予干预促使凋亡得到缓解。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机在笔者所在医院接受治疗的脓毒血症患者作为研究对象，共80例，且所有患者均于2015年12月-2016年12月入院治疗，所有患者均满足文献[3]2001年美国胸科医师协会/危重病医学会（ACCP/SCCM）诊断标准。采用随机数字抽取表法将患者分为对照组与观察组，每组40例患者，其中对照组男24例，女16例，年龄最小61例，最大78岁，平均（69.15±5.62）岁；观察组男25例，女15例，年龄最小61例，最大79岁，平均（69.23±5.44）岁。两组患者的基本资料，包含性别、年龄、急性生理学与慢性健康状况评分等在内的指标比较差异无统计学意义（P>0.05），可以进行对比研究。所有患者皆排除药物禁忌证，且无家族性遗传精神病史，均自愿签署本次试验知情同意书并或院内伦理委员会论证批准。

1.2 纳入标准

（1）年龄：60～80岁的成年患者；（2）急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ（APACHEⅡ）≥10分，且≤20分；（3）MODS评分≤5分；（4）起病后未应用除参麦外的免疫增强药物。

1.3 排除标准

（1）对参麦过敏；（2）治疗未超过24 h死亡或出院者；（3）合并非感染性炎症性疾病（烧伤、创伤、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣关节病、哮喘、炎症性肠病等）；（4）病毒血症；（5）真菌血症；（6）寄生虫血症；（7）肿瘤患者；（8）合并神经系统疾病包括脑血管意外及神经炎症等；（9）重度营养不良；（10）因病情需要行腹膜透析或连续性血液净化治疗等。

1.4 剔除标准

（1）病历资料严重不完整，影响统计分析结果；（2）未能按试验方案规定实施的病例；（3）出现头痛、不安、皮肤不适、流涎、呕吐并发症等或对参麦过敏甚至发生过敏性休克严重不良事件及其他原因致使继续试验困难。

1.5 治疗方法

所有患者入院后均及时均予生命征监护，必要时行机械通气，血流动力学监测，对患者每小时尿量做好记录，并行血常规、生化、血气分析、肝肾功能、累计脏器数目等检查；置入深静脉导管以监测ScvO2和/或CVP；将实验室检查结果、基础疾病、年龄等信息输入电脑，应用软件进行APACHEⅡ评分、MODS评分。两组患者均给予常规治疗，如液体复苏、抗感染、脏器支持、营养支持等治疗。常规治疗后，给予对照组采用脓毒症指南实施标准治疗，随后在诊断脓毒症第1、3、7、10天抽取新鲜外周血10 ml。随后应用ELISA检测Bcl-2和caspase-3。试验组在对照组治疗基础上选用参麦注射液40 ml加入250 ml 0.9%氯化钠注射液中进行治疗，控制60 ml/h速度静脉滴注，滴注过程中监测生命体征，试验组患者于诊断脓毒症当天以及使用参麦干预后（药敏试验阴性）第1、3、7、10天抽取新鲜外周血10 ml。应用ELISA检测Bcl-2和caspase-3。

1.6 观察指标

对两组患者的外周血淋巴细胞中抗凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子caspase-3含量及5、28 d全因死亡率等进行比较。

1.7 统计学处理

对于本次治疗期间所记录的数据均采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者Bcl-2、caspase-3含量比较endprint

通过分析表1可知，经过治疗后，试验组患者Bcl-2表达水平高于对照组患者Bcl-2表达水平，但差异无统计学意义（P>0.05）。试验组患者caspase-3阳性细胞个数低于对照组患者caspase-3阳性细胞个数，但差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 两组患者5、28 d全因死亡率比较

试验组患者5 d死亡例数为4例，全因死亡率为10.0%，28 d死亡例数为10例，全因死亡率为25.0%；对照组患者5 d死亡例数为5例，全因死亡率为12.5%，28 d死亡例数为10例，全因死亡率为25.0%。两组患者5、28 d全因死亡率数据比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

3.1 有证据显示，参麦可能改变脓毒症患者的caspase-3和Bcl-2水平，并有可能提高脓毒症患者生存率

3.1.1 脓毒症病理生理机制分为两个阶段-“前炎症阶段”及“免疫抑制阶段” 1991年，北美国家一致同意将脓毒症定义为已知感染灶的针对损伤或感染的宿主免疫反应（系统性炎症反应综合征，SIRS）[3]，即脓毒症是宿主对源于腹部、皮肤、肺和/或泌尿系感染的免疫反应综合征。其机制包括两个阶段：（1）前炎症阶段，指体内免疫系统释放炎症因子抗击感染。（2）免疫抑制阶段，即CARS（补偿性抗炎症反应综合征）紧随SIR之后[4]。

3.1.2 针对脓毒症第一阶段-“前炎症阶段”的治疗，临床试验证明效果欠佳，目前研究集中在针对第二阶段-“免疫抑制”阶段的治疗 学界一度认为这两个阶段发生在不同时间，故起初大部分试验主要针对前炎症阶段，其根据是大量前炎症阶段释放的炎症介质会导致器官损伤。目前多数针对感染的抗生素的应用常常可以使患者度过疾病的急性期，但发病数天甚至数周后的死亡率逐渐引起医疗界重视。

近年来，许多降低炎症反应的治疗措施如抗内毒素，抗TNF-α、抗IL-1beta和抗TLR-4等得到广泛研究，但均无法在临床起效[5-7]，进一步研究显示脓毒症的两个病理生理阶段常常同时存在，此外，尽管脓毒症的前炎症阶段与早期死亡率相关，但其晚期死亡率常与脓毒症的第二阶段免疫抑制阶段呈相关性[8]，而且超过70%的患者死亡发生在起病3 d后[9]。

免疫抑制在老年患者中比较普遍，因为高龄患者免疫系统更加薄弱，导致抗感染能力减弱[10-11]。免疫抑制的主要表现是淋巴细胞丢失，免疫抑制会导致低毒微生物或条件致病菌感染，如窄食单胞、假单胞、不动杆菌、肠杆菌或病毒感染，如巨细胞病毒、单纯疱疹病毒[12-14]。

3.1.3 在免疫抑制阶段抗击凋亡的治疗措施（升高Bcl-2及降低caspase-3）可使脓毒症动物模型得到缓解 多项动物实验及人类试验观察到脓毒症中存在淋巴细胞、树突细胞、胃肠上皮细胞、胸腺细胞丢失，这些免疫细胞的丢失主要是细胞程序性坏死，即外源性死亡受体及内源性的线粒体介导的细胞凋亡[15-19]，免疫抑制状态是由免疫效应细胞发生凋亡介导的[20]，当促及抑制凋亡的信号及分子，如Fas、FasL、B cell lymphoma-2（Bcl-2）、Bid 和caspase-3等受到限制或促进时，脓毒症的动物模型试验显示脓毒症得到缓解[21-25]，多项研究提示淋巴细胞丢失可能只是脓毒症免疫抑制的部分机制[26-27]，而且，随着对脓毒症淋巴细胞丢失的研究的加深，笔者了解到单纯针对某一个炎症因子或介质的治疗可能不足以改善脓毒症患者的预后或降低死亡率，故本试验采用参麦这种混合中药方剂，探讨其多方位控制免疫细胞凋亡现象后对脓毒症预后的影响。

3.1.4 凋亡与凋亡调节因子BCL-2、Bax、caspase-3 （1）凋亡：细胞凋亡，为一种细胞程序性死亡。相对于细胞坏死（necrosis），细胞凋亡是细胞主动实施的。细胞凋亡一般由生理或病理性因素引起。而细胞坏死则主要为缺氧造成，两者可以很容易通过观察区分开来。在细胞凋亡过程中，细胞缩小，DNA被核酸内切酶降解成180～200 bp片段属于有层次之断裂（可以通过凝胶电泳证明），而细胞坏死时，细胞肿胀，细胞膜被破坏，通透性改变。细胞器散落到细胞间质，需要巨噬细胞去清除，结果是该局部组织发炎。相比起细胞坏死，细胞凋亡是更常见的细胞死亡形式[28]。（2）Bcl-2、Bax：Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并且近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制[29]。目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类，一类是像Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1、线虫Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一类具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bax、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri。最初在血液淋巴细胞中发现Bcl-2能抑制细胞死亡，随后陆续在其他一些细胞中也发现Bcl-2的这种作用。但近年来研究发现，除这些之外尚存在Bcl-2不敏感的凋亡途径[30]。

Bcl-2是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因[31]，Bc1-2抑制氧自由基的产生或起到抗氧化剂的作用而阻断细胞凋亡[32]。Bcl-2是一种直接调节细胞凋亡的线粒体膜蛋白，其C末端含有1个由l9个氨基酸组成的疏水跨膜区，作为信号锚定序列，负责定位和插入到线粒体外膜，抑制细胞凋亡，其表达可对抗细胞内外的氧自由基对细胞的毒害与损伤作用，其在细胞内表达增强可以抑制或防止多种因素或因子诱发的细胞凋亡，延长细胞的寿命，是许多生理或病理凋亡的关键性调节因子。

Bax是最早发现的促凋亡因子，其中21%的氮基酸與Bcl-2同源。Bax分子结构中含有类似于抗凋亡成员的疏水C端，然而亚细胞分级和免疫组织化学实验均表明Bax在正常细胞中主要定位于细胞浆。虽然在线粒体上也发现有部分Bax存在，但Bax分子并非插入线粒体外膜内而是附着于线粒体表面[33]。endprint

Bcl-2家族成员复杂的相互作用通过控制线粒体外膜的透化作用（MOMP）而实现的。Bax在组织器官中的表达比Bcl-2更加广泛，主要分布在线粒体外膜上。正常情况Bax位于胞质，在凋亡信号诱导下，胞质内的Bax接到死亡信息使其构象发生改变，由胞质移位并插入到线粒体膜中，并在此形成微孔结构的低聚物Bax-Bax同源二聚体，然后激动MOMP[34]，开启线粒体通透性转换孔引起线粒体跨膜电位下降，释放凋亡前因子包括细胞色素C、omi/htra2、Smac/DIABLO和核酸内切酶G，释放的细胞色素C与凋亡蛋白活化因子（apoptosis proteinase activating factor-1，Apaf-1）、dATP及caspase-9前体结合形成凋亡小体而发生凋亡[35]。Bcl-2存在于线粒体外膜，其表达可竞争性地与Bax蛋白结合，形成比Bax/Bax同源二聚体更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而“中和”Bax/Bax诱导凋亡的作用，终止细胞凋亡的发生。决定细胞命运的关键因素是抑制与促进二者间的比率，Bc1-2、Bax分别是凋亡抑制和促进因子，其比值与细胞凋亡的发生直接相关，如二者表达量平衡则细胞生存期正常；当Bcl-2表达量较高时，形成异源二聚体Bcl-2/Bax，抑制细胞凋亡；当Bax表达量较高时，形成同源二聚体Bax/Bax，通过抑制Bcl-2的抗凋亡作用而促进细胞凋亡的发生[36]。因此有学者将Bc1-2和Bax的比值称作“凋亡开关”[37]。（3）caspase-3：caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降[38]。

3.1.5 参麦主要有效成分（Rb1，Rg）可升高Bcl-2及降低caspase-3 本试验采用正大青春宝药业有限公司提供的无溶媒半成品参麦注射液，每毫升试剂含50 mg生药（25 mg人参和25 mg麦冬，内容含人参皂苷Rg1，3274 μg；人参皂苷Re，2326 μg；人参皂苷 Rf，823 μg；人参皂苷Rc，1331 μg；人参皂苷Rd，782 μg；人参皂苷Rb1，3302 μg；人参皂苷Rb2，1312 μg；人参皂苷 Ro，2603 μg；麦冬皂苷D，10.3 μg）。

Jiang[39]发现人参可通过降低caspase-3和9的表达减轻皮质酮在PC12细胞诱发的凋亡。Zhao[40]发现人参的主要有效成分人参皂苷Rg1可减轻capase依赖的肝细胞凋亡。Bing[41]通过大鼠试验证实人参中的酸性多糖可以有效降低capase-3的表达。红参提取物可通过抑制Fas表达降低胚细胞凋亡[42]。2015年Huang[43]发现人参皂苷Rb1抑制脊髓缺血再灌注损伤所致的神经细胞凋亡。2014年Liu[44]发现人参皂苷Rb1可抑制Beta淀粉蛋白诱发的神经细胞凋亡。同年，Yan[45]等发现人参皂苷 Rb1可通过上调Bcl-2/Bax ratio和抑制caspase-3和9减少缺血诱发的心肌细胞凋亡。2014年，Park[46]发现人参皂苷Rg3通过激活caspase3、8、9诱发细胞凋亡。2013年Tian[47]发现人参皂苷Rb1可通过上调Bcl-xl及下调caspase3达到保护鼠前庭及听神经的目的。2012年，Chen[48]发现人参皂苷Rb1通过降低caspase-3基因的表达抗凋亡，而人参皂苷Rg1通过降低Fas基因表达减少凋亡。2005年Xu[49]发现人参皂苷Re可通过上调Bcl-2，抑制caspase-3来抵抗MPTP诱发的帕金森鼠黑质神经细胞凋亡。2002年，Liu等[50]发现人参皂苷Re可通过上调Bcl-2/Bax抑制心肌细胞凋亡。

3.2 本试验暂未发现参麦可影响脓毒症患者外周淋巴细胞caspase-3及Bcl-2水平，暂未发现参麦可影响脓毒症患者生存率

本次研究采用酶联免疫法检测不同时间段各组工作外周血淋巴细胞中抗凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子caspase-3含量，用于探讨参麦注射液对治疗脓毒血症患者的治疗效果的指标。研究结果显示，经过治疗后，试验组患者Bcl-2表达水平高于对照组患者Bcl-2表达水平，比较差异无统计学意义（P>0.05）。试验组患者caspase-3含量低于对照组患者caspase-3含量，比较差异无统计学意义（P>0.05），表明虽然采用脓毒症标准治疗和增加参麦注射治疗对Bcl-2表达水平、caspase-3含量等影响比较差异不明显，但采用增加参麦注射治疗的效果更好一点。此外试验组患者5 d死亡例数为4例，全因死亡率为10.0%，28 d死亡例数为10例，全因死亡率为25.0%；对照组患者5 d死亡例数为5例，全因死亡率为12.5%，28 d死亡例数为10例，全因死亡率为25%.两组患者5、28 d全因死亡率数据比较差异无统计学意义（P>0.05）。分析原因如下：第一，有证据显示参麦有效成分可以通过提高Bcl-2及降低caspase-3抑制凋亡[42-43，48，51]。但本试验结果与上述结论不符，考虑原因为：（1）目前研究Bcl-2及caspase-3与T淋巴细胞凋亡较多[51-56]，而研究Bcl-2及caspase-3与B淋巴细胞凋亡的较少[54-55]，目前上述两种指标在T及B淋巴细胞中的表达差别还不清楚，而本试验并未将两种淋巴细胞分离检验，不排除因含量差别导致阴性结果。（2）上述实验多研究人参中某一单一成分对相关指标的影响，而参麦注射液是含有多种复杂成分的中成药，成分之间可能会有交叉反应，进而影响实验结果，尤其目前对于麦冬对凋亡的相关研究较少，麦冬对人参中可能影响凋亡的相关成分的影响目前尚无报道。第二，在免疫抑制阶段抗击凋亡的治疗措施（升高Bcl-2及降低caspase-3）可使脓毒症动物模型得到缓解，应可能影响脓毒症患者的死亡率，但本试验与上述结论不符，考虑原因为：研究显示，脓毒症的前炎癥阶段与早期死亡率相关，晚期死亡率与脓毒症的第二阶段免疫抑制阶段相关[8]，但脓毒症的两个病理生理阶段“前炎症阶段”及“免疫抑制阶段”常常同时存在，本试验采用参麦抑制细胞凋亡虽主要针对免疫抑制阶段，如果时间上两阶段有重叠，那么对死亡率的影响可能还包括5 d以内的死亡率，这是本试验未做统计的。endprint

綜上所述，本试验提示，将参麦注射液应用在脓毒症患者治疗中，对于Bcl-2、caspase-3及5、28 d全因死亡率暂未发现有显著的影响。

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（收稿日期：2017-03-16）endprint