ISO 15189 在核酸检测性能验证方法中的应用价值

林松峰

ISO 15189 在核酸检测性能验证方法中的应用价值

林松峰

目的探讨经血传播疾病的核酸检测采用磁珠法-实时荧光PCR检测方法，针对这些方法进行性能验证，以符合国际标准化组织（ISO）15189的申报要求。方法针对血液筛查检测的核酸检测系统，进行重复性实验、灵敏度、特异性、符合率、符合性、检出限、抗干扰试验及稳定性等8个方面进行验证。结果8个方面的性能验证数据与相应的标准进行比较，所有性能验证结果都符合相应标准的要求。结论针对核酸检测采用的性能验证方法能够满足ISO 15189的要求，还能提高实验室对检测系统性能指标的认识，对实验室技术管理水平的提高起到重要作用。

ISO 15189；性能验证；核酸检测；血液筛查检测

输血传播感染性疾病的预防和控制是全社会关注的焦点，而在酶联免疫吸附试验（ELISA）基础上增加核酸检测已成为血站实验室的共识，其可缩短病原体检出的窗口期，检出献血者中存在的隐匿性感染[1]，降低经输血传播疾病的风险，进一步保障血液安全[2]。但是，核酸检测试剂的检测性能能否满足实验室的预期，检测系统的有效运转能否达到实验室的要求[3]，成为检测者需要考虑的问题。IOS 15189要求实验室必须对检测系统进行性能验证，本研究就本实验室在IOS 15189拟申请的过程中，对核酸检测方法的性能验证进行分析和探讨，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 样本选择①重复性：试剂的阴、阳性对照；②精密度：商品化标准品；③灵敏度及特异性：商品化血清评价盘；④符合性：室间质评标本；⑤最低检出限：商品化检出限标准品和阴性血清；⑥干扰试验：脂肪血：添加相同浓度标准品的脂肪血浆和正常血浆进行平行检测，溶血：添加相同浓度标准品的溶血标本和正常标本进行平行检测；⑦稳定性实验：选择丙型肝炎病毒（HCV RNA）项中等阳性，即循环阈值（CT值）在30～35之间的样本，根据离心时间和保存时间的长短进行分组平行检测。

1.2 试剂及辅料乙型肝炎病毒（HBV DNA）、HCV RNA、人类免疫缺陷病毒（HIV1RNA）（1+2型）、核酸检测试剂及质控试剂（罗氏诊断）。①核酸系列血清评价盘（康侧斯坦）；②精密性试验：HBV DNA核酸血清标准物质50 IU/ml、HCV RNA核酸血清标准物质 200 IU/ml、HIV1RNA核酸血清标准物质1000 IU/ml（康侧斯坦）；③检出限试验：HCV RNA核酸血清标准物质[世界卫生组织（WHO）标准品]；HBV DNA核酸血清标准物质；HIV1RNA核酸血清标准物质（康侧斯坦）；④真空采血管（科华）。

1.3 仪器CobasS201核酸检测系统（罗氏诊断）。

1.4 实验方法①重复性：在不少于 10 d的情况下进行20次检测。②精密度：一批次内检测标准品20次，计算批内精密度；连续20 d的检测数据，计算批间精密度。③灵敏度及特异性：一批次完成对血清盘的检测。④符合性：对参加的卫计委临检中心室间质评结果进行统计分析。⑤最低检出限：检出限标准品在同一批次检测27孔。⑥干扰试验：脂肪血：使用阴性脂肪血浆，添加标准品（HBV DNA 6.9 IU/ml、HCV RNA 50 IU/ml、HIV1RNA 150 IU/ml）。溶血：使用阴性血浆倍比稀释溶血标本，添加标准品（HBV DNA 6.9 IU/ml、HCV RNA 50 IU/ml、HIV1RNA 150 IU/ml）。⑦稳定性试验：将HCV RNA项中等阳性（CT值在30～35之间）样本，室温分别放置0、4、8、24和48 h离心。将离心后的阳性样本2～8 ℃放置0、1、2、3、4 d后进行检测。

1.5 判定标准①重复性：20次检测结果不能出现＞1次不符合说明书要求的情况。②精密度：批内精密度应≤2％，批间精密度应≤3％。③灵敏度、特异性和符合率判定标准：均为100％。④符合性判定标准：卫计委室间质评的结果符合性≥80％。⑤最低检出限判定标准：应满足26孔为阳性（95％置信区间），且满足厂家最低检出限（HBV DNA 2.3 IU/ml、HCV RNA 6.8 IU/ml、HIV1RNA 50 IU/ml）要求。

1.6 干扰试验①脂肪血标准应满足：脂肪血检测值与对照组检测值偏倚小于+7.5％；三酰甘油含量≤3300 mg/dL时，均不会干扰试剂的灵敏度和特异性。②溶血标准应满足：溶血检测值与对照组检测值偏倚小于+7.5％；血红蛋白含量≤500 mg/dL时，均不会干扰试剂的灵敏度和特异性。③稳定性试验判定标准：检测值与对照组检测值偏倚小于+7.5％。

2 结果

2.1 重复性阴、阳性对照实验结果20次，其检测结果为100％，均符合标准。见表1。

表1 重复性检测结果

2.2 精密度检测20次，均符合标准。见表2。

表2 精密度检测结果

2.3 灵敏度、特异性和符合率采用血型盘，其包含36份标本，通过计算，灵敏度、特异性、符合率均为100％。见表3。

表3 灵敏度、特异性和符合率检测结果

2.4 符合性实验室参加卫计委临检中心 2015年度第一次室间质评，合计10份标本，其中HIV1RNA反应性2例，HBV DNA反应性3例，HCV RNA反应性3例，符合性为100％。

2.5 最低检出限该检测系统在本实验室的最低检出限，其中HBV、HIV1均满足生产商的要求（95％置信度）；HCV经SPSS统计软件分析其95％最低检出限为16.03 IU/ml，不符合说明书要求。见表4。

表4 最低检出限检测结果

2.6 干扰试验

2.6.1 脂肪血检测结果 经试验验证，380 mg/dL的三酰甘油对各项检测均无明显影响，且偏倚均未超过+7.5％。见表5。

表5 脂肪血检测结果

2.6.2 溶血检测结果 经试验验证，血红蛋白浓度为2800 mg/dL的溶血标本对各项检测无影响，且偏倚均未超过+7.5％。见表6。

表6 溶血检测结果

2.7 稳定性

2.7.1 室温放置后的稳定性评价 每份样品检测3次，取均值与对照组（0 h）相比，检测值（CT）偏倚均小于+7.5％，符合预期。见表7。

表7 室温放置后的检测结果

2.7.2 离心后冷藏放置的稳定性评价 每份样品检测3次，取均值与对照组（0 d）相比，CT值偏倚均小于+7.5％，符合预期。见表8。

表8 离心冷藏放置后的检测结果

3 讨论

实验室的方法学验证是申请 ISO 15189时必须提供的数据材料，能如实反映实验室的检测水平，其中的重要因素即为试剂与其配套设备组成的检测系统，根据要求只有符合实验室预期的检测系统才能应用于检测，并且对验证的性能指标和验证方法的选择有着比较明确的说明[4]，而血站实验室根据行业标准[5]的要求也需要对检测方法进行验证，方法确认应尽可能全面，并通过客观证据（以性能特征形式）证实满足试验预期用途的要求[6]。

另外，样本的选择也十分重要，要能反映验证指标的特性，要有溯源性，从而全面地保证验证的客观性。而在实际的验证过程中发现，在HCV RNA的最低检出限试验中，无论康侧斯坦还是WHO的标准品均不能在本实验室复现说明书标注的检测下限，经与生产商沟通，其向实验室提供证明材料说明该试剂最低检出限符合要求。其次，脂肪血和溶血标本对于核酸检测的影响是非常重要的[7]，但是通过本试验数据可以看出，一定浓度的脂肪血和溶血对试验的干扰在一定程度上是可以接受的。在实际工作中，标本的采集、处理、保存不当，均会造成核酸酶污染的假阳性或病毒核酸降解的假阴性，从而影响检测结果的真实性[8]，故标本的前处理关系到检验结果的准确与稳定。为此设计了稳定性试验以模拟超限情况对中强度阳性标本的影响，数据表明偏倚是符合预期的，但并不能说明超限的外部条件对低浓度阳性标本的影响可以忽略不计，尤其是HCV RNA的稳定性较差，短时常温保存都会造成病毒核酸的降解[9]，故核酸标本应该始终处于合理的保存温度，并在规定时限内完成检测。通过对各项指标的验证，确认系统的分析灵敏度已经达到了生产商的检测要求，实验室已经具备了系统所要求的检测能力[10]。同时，对于试剂、物料的选择也有一定的参考作用，以提高实验室的整体检测水平，进一步保证临床输血的安全。

[1] 欧山海,林永财,倪宏英,等.核酸检测后血液检测模式的探讨[J].中国输血杂志,2012,25(3):244-246.

[2] 彭小华,李丽平,欧阳刚,等.核酸检测技术在血液筛查中的应用研究[J].中国输血杂志,2015,6(49):52-53.

[3] 周丽君,姚华,王丽鸿,等.核酸检测技术在血液病毒筛查中的应用进展[J].新疆医学,2013,43(8):1-6.

[4] 中国合格评定国家认可委员会.医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明(CNAS-CL36:2012)[M]北京:中国合格评定国家认可委员会,2014.

[5] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.血站技术操作规范(2015版)[S].北京:中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会, 2015.

[6] 中国合格评定国家认可委员会.医学实验室质量和能力认可准(CNAS-CL02:2012)[S].北京:中国合格评定国家认可委员会,2014.

[7] 刘小敏,唐恒峰,李文郎,等.高脂血、溶血标本对荧光定量聚合酶链反应测定低水平HBV-DNA的影响[J].检验医学与临床,2015, 21(33):76-77.

[8] 严秀娟,邱昌文,石庆秋,等.核酸血液筛查标本的质量控制[J].中国医药指南,2012,10(31):383-384.

[9] 熊玉娟,周华友.不同保存条件对丙型肝炎病毒核酸稳定性的影响[J].中国输血杂志,2012,25(6):549-552.

[10] 姚凤兰,汪德海,查炜,等.Procleix TIGRIS核酸分析系统分析性能及操作性能确认研究[J].中国输血杂志,2014,27(4):361-366.

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.02.047

辽宁省血液中心，辽宁沈阳 110044

林松峰（1977.4-），本科学历，医务工作人员，主管检验师。研究方向：检验方面。E-mail：lxn060109@163.com