高效液相色谱法测定复方金银花颗粒中绿原酸的含量

范婉思张贞婵胡建焜

高效液相色谱法测定复方金银花颗粒中绿原酸的含量

范婉思1张贞婵2胡建焜1

目的为提高复方金银花颗粒的质量控制，通过高效液相色谱法测定复方金银花颗粒中药效成分的绿原酸含量。方法色谱柱：DIKMA Diamomsil（TM）C18柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流动相：乙腈：0.3％磷酸（15:85）（v/v）；流速：1.00 ml/min；检测波长：326 nm；柱温：30 ℃。采用高效液相色谱法对复方金银花颗粒中的绿原酸研究进行，包括（系统适应性试验、线性关系考察、精密度考察、稳定性考察、重现性考察、加样回收试验10批复方金银花颗粒中绿原酸进行含量测定）。结果复方金银花颗粒中绿原酸进样量在一定范围内与峰面积呈线性关系（r=0.9999），本方法中绿原酸检测的平均加样回收率为97.02％，RSD值为0.52％（n=6）。结论高效液相色谱法测定复方金银花颗粒中绿原酸含量具有简捷、准确、重现性好等特点，可作为复方金银花颗粒中绿原酸质量控制的依据。

复方金银花颗粒；绿原酸；高效液相色谱法；含量测定

金银花是我国传统的常用大宗药材之一，特别是在非典时期发挥了极其重要的作用，以金银花配方的中药制剂也是人们家用的常备药品。2015年版《中国药典》金银花的来源为忍冬科植物忍冬（Lonicerajaponica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花[1]。金银花、连翘、黄芩等三味药系复方金银花颗粒组成药材，该复方制剂常用于热感、扁桃体炎、咽炎、目痛等症状[2]。复方金银花颗粒中金银花为主药，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及解毒抗炎作用，其主要活性成分为绿原酸[3-4]。现代药理学研究表明，绿原酸具有广谱抗菌、增强免疫及解热抗炎等多种药理活性[5-8]。现行检验标准中，复方金银花颗粒定性鉴定绿原酸简单快捷，但随着我国对中成药质量控制水平的提高，化学定性方法已无法满足标准的要求。本实验通过高效液相色谱（HPLC）法，寻求一种高效可控的方法，测定复方金银花颗粒中绿原酸的含量，以便更好控制经典中成药的质量。

1 实验材料

1.1 仪器VARIAN 210型高效色谱仪，色谱柱：DIKMA Diamomsil（TM）C18（250 mm×4.60 mm，5 μm），1/10万电子天平（GR-202，A&D日本）。

1.2 试药 甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水；绿原酸对照品：中国药品生物制品检定所提供，批号：130715-201016；复方金银花颗粒：修正药业集团长春高新制药有限公司生产，批号：1310301、1212041、1205012；10批次复方金银花颗粒实验室自制，批号：1501-1510。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：ULTIMATE×B C18（250 mm× 4.60 mm，5 μm），流动相：乙腈：0.3％磷酸（15:85），检测波长326 nm，流速：1.0 ml/min，柱温：30 ℃。

2.2 对照品溶液的配制精密称取在 120 ℃减压干燥至恒重的绿原酸对照品11.6 mg，置100 ml容量瓶中。定容时选用甲醇作为溶剂，并对绿原酸进行溶解，最终定容置刻度线，摇匀，即为对照母液（浓度116 μg/ml）。再精密吸取对照母液4 ml，置10 ml容量瓶，用甲醇稀释定容置刻度，按照要求摇匀，即为对照品溶液（46.4 μg/ml），微孔滤膜滤过备用。

2.3 复方金银花颗粒供试样液的配制精密称取复方金银花颗粒0.5 g，适量甲醇溶解于锥形瓶，精密称定锥形瓶总重量，超声30 min，称重，甲醇补足重量，并将其混匀，滤纸过滤，精密量取1.0 ml，置10 ml容量瓶，用甲醇稀释定容置刻度，按照要求摇匀，微孔滤膜过滤，即为复方金银花颗粒供试样液。

2.4 测定紫外检测器的波长设定将配制好的绿原酸对照品溶液，在紫外可见区域内200～600 nm处进行扫描，发现绿原酸在326 nm处有最大吸收峰，且用供试品溶液扫描发现辅料对其不存在干扰，故选定326 nm为测定波长。

2.5 系统适应性试验分别取上述绿原酸对照、复方金银花颗粒供试品、按处方量制备缺金银花的阴性对照样品。按照液相操作要求进行进样，发现供试液在相同位置上与绿原酸对照有相同的峰，结果见图1。

2.6 线性关系考察分别精密量取绿原酸对照储备液（116 μg/ml）1、2、3、4、5、6、7、8 ml，置10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，液相进样，采用流速为每分钟1.0 ml，测定绿原酸峰面积。以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，得标准曲线方程为：Y=28.088 X+0.886（r=0.9997），进样量在0.200 μg～1.800 μg之间时，该回归曲线有良好的线性关线。

图1 绿原酸测定HPLC

2.7 精密度考察密量取绿原酸对照储备液（116 μg/ml）5 ml，置10 ml容量瓶中，用甲醇定溶，配得对照品溶液（浓度58 μg/ml）。进样20 μl，重复进样6次，测定绿原酸平均峰面积为26.4838，RSD为0.68％。

2.8 稳定性试验精密称6份复方金银花颗粒1.002 g，配制方法参照2.3项下方法，于0、2、4、6、8、10 h进样20 μl，测定绿原酸平均峰面积为19.0098，RSD为1.99％。

2.9 重现性考察精密量取绿原酸对照储备液（116 μg/ml）4 ml，置10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，滤过，即为对照品溶液（浓度46.4 μg/ml）。供试液的配制：取1310301批复方金银花颗粒0.5 g，共6份，参照见2.3项下方法进行配制溶液，进样20 μl，测定6份供试品绿原酸平均含量为26.4314 mg/g，RSD为1.07％。

2.10 加样回收率试验取 1310301批复方金银花颗粒0.5 g，共6份，精密称定，置50 ml容量瓶中，加甲醇接近刻度时超声 30 min，取出放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤纸过滤，前5 ml弃去，余液收集，从中精密吸取1 ml移入10 ml容量瓶，再精密加入绿原酸对照储备液（116 μg/ml）2 ml后用甲醇稀释到刻度，摇匀、微孔滤膜滤过，既得。测定：取上述样液分别进样20 μl，测定峰面积，结果见表1。

表1 复方金银花颗粒供试品中绿原酸的加样回收率试验结果

表2 10批复方金银花颗粒中绿原酸含量测定结果

2.11 复方金银花颗粒中绿原酸含量测定取10个不同批号复方金银花颗粒，精密称定，配制方法见2.3项下供试品样液的配制方法，得供试品样液。取以上对照液和10份样品供试液分别进样，测定结果见表2。

3 讨论

本实验考察了乙腈-2％磷酸、乙腈-1％冰醋酸、乙腈-3％磷酸等流动相，最终确定乙腈-3％冰醋酸（15:85）作为流动相，流速为1.0 ml//min，分离效果良好。取绿原酸对照在200～600 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，结果表明绿原酸在326 nm处有最大吸收峰，因此，选择326 nm为检测波长。10个不同批次的产品中绿原酸的含量在为 1.00％～1.39％，考虑到测定偏差等多种因素，绿原酸含量应不低于0.9％。本实验曾以乙酸乙酯、甲醇作为提取溶剂进行实验，结果发现，用甲醇作为提取溶剂时，所得的绿原酸和黄芩苷的量大，样品中的成分提取比较完全，因此，本实验确定用甲醇作为提取溶剂。本实验将样品分别超声30、60、80 min后测定绿原酸的含量，结果含量无明显差别，故确定超声时间为 30 min。本实验测定了 10批复方金银花颗粒，HPLC法测定发现，不同批次间，绿原酸含量差异小，仅有1507批次的复方金银花颗粒存在绿原酸含量差异，但差异不大。用 HPLC法测定复方金银花颗粒中绿原酸的含量，具有准确性高，重现性好，且操作简便快速等优点，可作为复方金银花颗粒中绿原酸质量控制的依据。

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Determination of Chlorogenic Acid in Compound Lonicera Granules by HPLC

Fan Wansi Zhan Zhenchan Hu Jiankun

Compound Lonicera Granules;Chlorogenic acid;HPLC;Determination

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.02.007

1广东省中医院药剂科，广东广州 510120

2广州白云山和记黄埔中药有限公司质量管理部，广东广州 510515

范婉思（1983-），本科学士，中药师。研究方向：临床中药学。E-mail：chasefan@163.com

【Objective】ObjectiveTo establish the method for the determination chlorogenic acid in Compound Lonicera Granules.which provides a reliable method for the quality control of Compound Lonicera Granules.MethodsThe HPLC method was used.Column:DIKMA Diamomsil(TM)C18(5 μm,250 mm×4.6 mm).The mobile phase: acetonitrile -0.2％ phosphonic acid=(20:80)(v/v).The flow speed:1.0 ml.min-1.The wavelength was at 326 nm.The column temperature:30 ℃.Study on chlorogenic acid of compound Compound Lonicera Granules which included (the system suitability test,linear relation test,precision,stability,reproducibility of investigation,chlorogenic acid recovery test the 10 batch of the same factory compound Lonicera granules was determined).ResultsThe regression equation of chlorogenic acid was linear in the range of 0.232 μg～1.856 μg(r=0.9999),the average recovery method was 97.02％,RSD was 0.52％(n=6).ConclusionThe method was stable and accurate.It is suitable to determine chlorogenicacid in Compound Lonicera Granule and can be applied to the content control for compoud lonicera granules.