发酵型核桃乳生产专用乳杆菌的选育

赵娟娟，吴荣荣，程书梅

（1.衡水学院生命科学系，河北衡水053000；2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

发酵型核桃乳生产专用乳杆菌的选育

赵娟娟1，吴荣荣1，程书梅2

（1.衡水学院生命科学系，河北衡水053000；2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

从发酵面包、白芥丝、泡菜、酸菜中分离到14株乳杆菌，经核桃乳发酵产酸特性初筛，确定菌株L5、L7、L8及L12适合核桃乳发酵。通过菌落形态、菌体形态和16S rRNA基因序列分析，确定4株菌分别为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。将上述菌株与实验室保存的嗜热链球菌SA进行核桃乳发酵实验，感官评分分别为78分、95分、83分和82分；4个发酵核桃乳中9种氨基酸含量均有不同程度提高，其中菌株L7发酵产品的氨基酸含量增幅最大，由0.67%增至1.60%。因此副干酪乳杆菌L7更适合发酵型核桃乳的生产。

发酵型核桃乳；乳杆菌；分离；鉴定

核桃仁营养成分丰富，其中主要成分是脂肪、蛋白质和碳水化合物，此外还含有丰富的膳食纤维、维生素及矿物质元素。核桃乳是以核桃仁为原料经浸泡、磨浆、过滤、均质、杀菌后制成的植物蛋白饮品[1-2]。

核桃乳在乳酸菌的发酵过程中，能使其中的蛋白质分解，且矿物质、肽、氨基酸、B族维生素等物质含量增加，可提高肠胃的消化吸收率[3-5]；同时乳酸菌的产香、产酸特性，使得发酵型核桃乳的风味更加浓厚，形成适口、风味独特的饮品，增加了产品的肠道保健功能[6-8]。

本研究从不同来源的植物材料中，分离适合核桃乳发酵的乳杆菌，并对菌株进行形态和16S rRNA基因序列，确定其分类地位，最后进行核桃乳发酵实验，确定最佳乳杆菌菌株。以期为发酵核桃乳的生产提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）SA：从发酵面包中分离得到，保存于衡水学院微生物实验室。

乳杆菌：从发酵面包、白芥丝、泡菜、酸菜等食品中分离。

MRS培养基：大豆蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉5.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐温80 1.0 g/L，K2HPO4·7H2O 2.0 g/L，三水醋酸钠5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，MnSO4·4H2O0.05g/L，琼脂粉15.0g/L。pH6.2，分装后121℃高压灭菌15～20 min，固体培养基需加入琼脂1.3%～1.5%。

番茄汁琼脂（tomato juice agar，TJA）培养基：番茄汁50.0g/L，酵母膏5.0g/L，牛肉膏10.0g/L，葡萄糖2.0g/L，乳糖20.0g/L，乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，吐温80 1.0 g/L。pH6.6～7.0，121℃灭菌15 min，固体培养基需加入琼脂1.3%～1.5%。

1.2 仪器与设备

TakaraThermalCyclerDiceTP600聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：日本TaKaRa公司；Mupid电泳仪：美国Major Science公司；ImageMaster VDS电泳成像装置：安发玛西亚生物技术公司；ABIPRISM3730XLDNASequencer脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）测序仪：美国应用生物系统公司；DM3000显微镜：德国徕卡公司。

1.3 方法

1.3.1 乳杆菌的分离纯化

上述植物源产品过滤后吸取1 mL（面包为1 g），用无菌生理盐水10倍稀释至10-5、10-6和10-7。取0.1 mL稀释后样品均匀涂布在MRS培养基上，37℃倒置培养48 h，划线法分离纯化获得菌株。经镜检为纯培养物后转入固体斜面上，一部分于甘油保存，一部分在4℃冰箱中保存[9-11]。

1.3.2 乳杆菌的形态特征

将分离的菌种接种在MRS培养基上，37℃恒温箱中培养48h，观察菌落的形态。菌株进行革兰氏染色后用油镜观察菌株的形态[12-13]。

1.3.3 乳杆菌的16S rRNA基因序列分析

将乳杆菌的培养液使用TakaraMiniBEStBacteriaGenomic DNA ExtractionKitVer.2.0（Code No.DV810A）试剂盒进行基因组DNA的提取，取1μL进行琼脂糖凝胶电泳。以基因组DNA为模版，使用Takara16SrRNABacterialIdentificationPCR Kit（CodeNo.D310）扩增，以特异性引物，乳杆菌L1目的片段，取5μL进行琼脂糖凝胶电泳。使用TakaraAgaroseGelDNA PurificationKitVer.2.0（CodeNo.DV805A）切胶回收目的片段，取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳。回收产物在宝生物工程有限公司测序，测序结果在GeneBank中利用Blast程序进行比对。

1.3.4 核桃乳的发酵工艺流程

1.3.5 测定方法

发酵核桃乳感官评价：以色泽、香气、滋味及形态作为核桃乳感官评分指标，邀请10人进行试饮评判。评分结果取其平均值计算[14-15]，满分100分，感官评分标准见表1。

表1 发酵核桃乳感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of fermented walnut milk

氨基酸含量采用氨基酸自动分析仪进行检测。酸度测定：取乳样10 mL，加入20 mL蒸馏水和2～3滴酚酞试剂，用标定过的0.1004mol/LNaOH溶液进行滴定，酸度用吉尔涅尔度（°T）表示。

2 结果与分析

2.1 乳杆菌的分离及形态特征

共采集样品4份，从中分离得到乳杆菌14株，分别命名为L1～L14，乳杆菌形态特征见表2。代表菌株L7的细胞及菌落形态特征见图1。

表2 乳杆菌形态特征Table 2 Morphological characteristics ofLactobacillus

图1 菌株L7的菌体（A）和菌落形态（B）Fig.1 Mycelial(A)and colony morphology(B)of strain L7

由表2可知，来自发酵面包的乳杆菌6株，占总分离菌株的43%；来自白芥丝的乳杆菌2株，占总数的14%；来自泡菜的乳杆菌4株，占总数的29%；来自酸菜的乳杆菌2株，占总数的14%。分离后的乳杆菌主要以细长杆状占优势。

由图1可知，分离得到的乳杆菌，细胞形态为杆状，以单个或链状存在，在MRS固体培养基上培养2 d后，形成乳白色圆形菌落，且表面光滑，边缘整齐，无褶皱，直径约1 mm。

2.2 乳杆菌的初筛

将乳杆菌L1～L14分别与实验室保存的嗜热链球菌SA进行核桃乳发酵实验，产品酸度的检测结果见表3。

表3 不同菌株发酵核桃乳酸度测定结果Table 3 Determination results of acidity in walnut milk fermented by different strains

由表3可知，经过菌株L5、L7、L8、L12制备的发酵核桃乳酸度为40～45°T，感官评价结果表明，由上述菌株制备的核桃乳酸甜适口，可作为后续研究的菌株。

2.3 乳杆菌序列分析结果

将4个菌株的16S rRNA序列提交到GenBank数据库进行比对，结果见图2。

图2 菌株L5、L7、L8和L12的16S rRNA序列的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences of strains L5,L7,L8 and L12

由图2可知，菌株L5与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）CP005485.1的16S rRNA基因的相似性达到100%，结合菌体形态特征，菌株L5鉴定为鼠李糖乳杆菌；L7与副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）CP007122.1的16S rRNA基因的相似性达到100%，结合菌体形态特征，菌株L7鉴定为副干酪乳杆菌；L8与食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）KJ095645.1的16S rRNA基因的相似性达到99%，结合菌体形态特征，菌株L8鉴定为食窦魏斯氏菌；L12与干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CP006690.1的16S rRNA基因的相似性达到100%，结合菌体形态特征，菌株L12鉴定为干酪乳杆菌。

2.4 发酵核桃乳感官评价结果

将乳杆菌L5、L7、L8、L12与嗜热链球菌SA进行核桃乳发酵实验，得到发酵核桃乳。分别为样品1、样品2、样品3、样品4，感官评定结果见表4。

表4 不同菌株发酵核桃乳感官评分结果Table 4 Sensory evaluation results of walnut milk fermented by different strains

由表4可知，样品2的感官评分结果最高，白色微显灰色，具有核桃香气，酸甜适口，乳酸味浓厚且柔和，均匀一致。

2.5 发酵核桃乳氨基酸含量

将乳杆菌L5、L7、L8、L12与嗜热链球菌SA进行核桃乳发酵实验，分别为样品1、样品2、样品3、样品4，氨基酸含量检测结果见表5。

表5 不同菌株发酵核桃乳氨基酸含量检测结果Table 5 Determination results of amino acid contents in walnut milk fermented by different strains %

由表5可知，发酵型核桃乳与未发酵的对照相比，总的氨基酸含量均有不同程度的提高，菌株L7发酵后产品氨基酸含量增幅最大，由0.67%提高至1.60%，其中赖氨酸含量提高了5倍，亮氨酸含量提高了1.5倍。赖氨酸是核桃的第一限制性氨基酸，亮氨酸有助于血糖控制，重点考虑了这两种，综合感官评价分数，最终选择了菌株L7。

3 结论

本研究从特定植物来源的材料中分离得到了L5、L7、L8、L12四株乳杆菌。通过菌落形态、菌体形态和16S rRNA基因序列分析，分别鉴定为鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、食窦魏斯氏菌、干酪乳杆菌。将上述菌株与实验室保存的嗜热链球菌SA进行核桃乳发酵特性试验，结果表明，采用菌株L7与实验室保存的嗜热链球菌SA发酵得到的发酵核桃乳感官评价最佳，且具有较高的营养价值，适合用在核桃乳的发酵生产中。

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Screening ofLactobacillusused for fermented walnut milk

ZHAO Juanjuan1,WU Rongrong1,CHENG Shumei2
(1.Department of Life Science,Hengshui University,Hengshui 053000,China; 2.College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

14 strains ofLactobacilluswere isolated from fermented bread,white mustard silk,pickles and Chinese sauerkraut.After preliminary screening based on acid-producing characteristics in walnut milk fermentation,4 strains(strains L5,L7,L8 and L12)which were suitable for walnut milk fermentation were determined.By colonial morphology,mycelial morphology and 16S rRNA gene sequence analysis,4 strains were identified asLactobacillus rhamnosus,Lactobacillus paracasei,Weissella cibariaandLactobacillus casei,respectively.The identified strains and laboratory preservedStreptococcus thermophilusSA were tested for the fermentation of walnut milk.The sensory evaluation score of fermented walnut milk were 78,95,83 and 82,respectively.9 kinds of amino acids contents in 4 fermented walnut milks were increased in different degrees,in which the increasing amplitude of amino acid content in the product fermented by strain L7 was the highest and increased from 0.67%to 1.60%.L.paracaseiL7 was more suitable for the production of fermented walnut milk.

fermented walnut milk;Lactobacillus;isolation;identification

TS201.1

0254-5071（2017）06-0107-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.022

2017-02-21

赵娟娟（1982-），女，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。