10种非酿酒酵母硫化氢产生能力及动态分析

王优蓓，肖凤，季雪傲，陈福生，张秀艳*

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070；2.华中农业大学环境食品学教育部重点实验室，湖北武汉430070）

10种非酿酒酵母硫化氢产生能力及动态分析

王优蓓1，2，肖凤1，2，季雪傲1，2，陈福生1，2，张秀艳1*

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070；2.华中农业大学环境食品学教育部重点实验室，湖北武汉430070）

为了分析10种非酿酒酵母产H2S动态以及与发酵速度的相关性，该研究利用亚硫酸铋琼脂平板法和醋酸铅试纸法分别分析了10种酵母在固态和液态条件下产H2S的情况，并对其H2S产生动态以及与发酵速度的相关性进行分析。结果表明，在亚硫酸铋琼脂固态平板上，7种非酿酒酵母产生H2S，而在YPD液体培养基中，10种非酿酒酵母均产生H2S，产H2S的能力差异明显，热带假丝酵母产H2S最多，且产气速度与发酵速度呈正相关。该研究结果将为非酿酒酵母的应用提供了参考依据，并为其他非酿酒酵母以及其他发酵微生物的筛选提供借鉴意义。

非酿酒酵母；硫化氢；醋酸铅试纸法；亚硫酸铋琼脂平板法

果酒因具有较高的营养和保健功能，契合了当代人们对绿色和健康理念的追求，深受消费者青睐[1]。随着“由高度酒向低度酒，由粮食酒向果酒发展”的酒业政策调整，果酒市场蓬勃发展，果酒风味差成为困扰果酒发展的限制性因素。造成这一问题的主要原因是利用纯种酿酒酵母进行发酵（即纯种发酵）。纯种发酵操作简单、易控制、果酒品质统一，但酿酒酵母产生风味物质少，导致果酒风味差[2]。

近年来，利用非酿酒酵母与酿酒酵母的混合发酵改善果酒风味成为了研究的热点[3-6]，多款果酒的风味得到改善[7-9]。项目组也已从自然发酵柑橘酒中分离了10种非酿酒酵母，并对其发酵特性和耐受性进行分析，显示了10种非酿酒酵母具有改善果酒风味能力，且耐受性和发酵性能较好[10-12]。然而，非酿酒酵母可能会产生不良风味物质，如含硫化合物、醋酸和高级醇[13]。H2S是挥发性最强的含硫化合物，有臭鸡蛋味，人对H2S的嗅觉阈值很低，每升含数十至数百微克时对感官刺激明显[14]，因此H2S产生可能会造成果酒不良风味。不同种酵母产H2S能力差异较大[15]，因此有必要开展非酿酒酵母产H2S能力的分析。

鉴于此，本研究对10种非酿酒酵母产生H2S情况及其动态变化进行分析，在用亚硫酸铋琼脂法分析固态平板上非酿酒酵母产H2S情况基础上，用醋酸铅试纸法分析非酿酒酵母液体发酵时产H2S情况，并对其产生动态及其与发酵速度的相关性进行分析，研究结果将为10种非酿酒酵母在果酒中的应用提供指导，并为其他非酿酒酵母，甚至其他发酵微生物的筛选提供借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

加利福尼亚拟威尔酵母（Barnettozyma californica），矮小假丝酵母（Candida humilis），热带假丝酵母（Candida tropicalis），葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae），葡萄汁蓟马酵母（Hanseniaspora occidentalis），仙人掌有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae），葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum），毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），陆生毕赤酵母（Pichia terricola），德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）：华中农业大学环境食品学教育部重点实验室。

分析所用试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，过滤后121℃湿热灭菌20min；亚硫酸铋琼脂培养基（bismuthsulfite agar，BS）：青岛高科园海博生物技术有限公司，加热煮沸至完全溶解，无需高压灭菌，保存于黑暗处，48 h内使用。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-IF型超净工作台：苏中净化设备有限公司；DNP-9162型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HZ250LB型摇床：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；AR5120型电子天平：美国奥豪斯公司；GI80TR型高压蒸汽灭菌锅：美国致微仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亚硫酸铋琼脂平板法分析10种非酿酒酵母产H2S情况

用接种环刮取2环酵母至装有6 mL YEPD培养基的试管中，28℃，120 r/min培养12 h。取2 mL活化菌液至2 mL离心管中，4℃、5 000 r/min离心5 min，收集菌体，加入2 mL无菌生理盐水洗涤，共洗涤3次。用血球计数板计数后，加入900 μL无菌生理盐水系列稀释酵母浓度至106个/mL。用镊子夹取灭菌的滤纸片贴在事先准备好的亚硫酸铋培养基表面，吸取10μL浓度为106个/mL的菌液并慢慢滴加在滤纸片上，待液体完全吸入培养基后，28℃倒置培养5 d，观察培养基的变色情况，产H2S能力由高到低的显色情况分别为显棕黑色、棕色、墨绿色、淡墨绿色及不显色。

1.3.2 检测用醋酸铅试纸的制备

将滤纸裁成1.5 cm×10 cm的纸条，卷成纸卷插入塑料管（直径为8 mm）中并121℃湿热灭菌20 min。均匀滴加200 μL过滤除菌（0.45 μm硝酸纤维素膜）的0.3%醋酸铅溶液于滤纸片上，室温下自然晾干后备用。

1.3.3 醋酸铅试纸法分析10种非酿酒酵母产H2S情况

参照韩娜等[16]的方法。在装有80mLYEPD培养基的三角瓶（100 mL）中接入100 μL种子液，将标好刻度的醋酸铅试纸条插入式管并将试管插入三角瓶，28℃、120 r/min培养5 d，读取试纸变色长度。H2S的生成量越多，试纸变色长度越长。试纸变色原理是酵母生成的H2S与滤纸条上的醋酸铅反应，生成黑色的硫化铅，由于浸泡滤纸条的试剂总量已知，所以可以测量试纸变色的长度来换算不同酵母H2S的生成量，试纸条每显色1 mm表示H2S的生成量为7.86 μg/L。

1.3.4 10种非酿酒酵母产H2S动态分析

活化、接种、培养方法同1.3.3，每12 h读取试纸变色长度，以时间（h）为横坐标，H2S累计生成量（μg/L）为纵坐标，做出10种非酿酒酵母产H2S的动态曲线。

1.3.5 10种非酿酒酵母产H2S和发酵速度关系分析

活化、接种、培养方法同1.3.3，每12 h读取试纸变色长度，称量法计算发酵液失去的质量（即CO2释放量），以时间（h）为横坐标，H2S累计生成量（μg/L）和CO2累计释放量（mg/L）为纵坐标，作10种非酿酒酵母产H2S和发酵速度关系图。

2 结果与分析

2.1 亚硫酸铋琼脂平板法分析10种非酿酒酵母产H2S情况

通过方法1.3.1分析了10种非酿酒酵母在亚硫酸铋琼脂平板上产H2S能力，结果见图1。由图1可知，H.uvarum、C.lusitaniae、T.delbrueckii几乎不产H2S，C.tropicalis、P.terricola、B.californica、H.occidentalis、H.opuntiae、P.kudriavzevii、C.humillis均产H2S。产H2S能力最强的为P.kudriavzevii，其次为B.californica、H.opuntiae，而P.terricola、C.humillis产H2S能力较弱，C.tropicalis、H.occidentalis产H2S能力很弱。

图1 亚硫酸铋琼脂平板法分析10种非酿酒酵母产H2S情况(28℃,5 d)Fig.1 H2S production conditions of ten non-Saccharomyceson the bismuth sulfite agar medium(28℃,5 d)

2.2 醋酸铅试纸法分析10种非酿酒酵母产H2S情况

由10种非酿酒酵母在亚硫酸铋培养基上生长的结果可以初步判定各菌株产H2S情况，但工业生产多数为液态发酵，酵母在液态培养基中产H2S情况可能会有所不同，因此利用醋酸铅试纸法测定酵母在YEPD培养基中H2S的生成量，进一步探究10种非酿酒酵母的产H2S情况。通过方法1.3.3进一步探究10种非酿酒酵母在液态培养基中生长时产H2S情况，结果如图2所示。

图210 种非酿酒酵母在YEPD培养基条件下产H2S情况(28℃,5 d)Fig.2 H2S production conditions from ten non-Saccharomyceson YEPD medium(28℃,5 d)

由图2可知，10种非酿酒酵母均产H2S，其中P.kudriavzevii产H2S量最高，H.opuntiae最低。10种非酿酒酵母产H2S为P.kudriavzevii（189.82 μg/L）＞C.tropicalis（130.15 μg/L）＞C.humillis（84.63 μg/L）＞P.terricola（70.80 μg/L）＞B.californica（38.44 μg/L）＞H.occidentalis（25.29 μg/L）＞C.lusitaniae（17.53 μg/L）＞H.uvarum（15.51 μg/L）＞T.delbrueckii（13.49 μg/L）＞H.opuntiae（10.11 μg/L）。

醋酸铅试纸法筛选出的低产H2S酵母为C.lusitaniae、H.uvarum、T.delbrueckii和H.opuntiae，亚硫酸铋平板法筛选出的低产H2S酵母为C.tropicalis、H.occidentalis、H.uvarum、C.lusitaniae和T.Delbrueckii。H2S大部分是来自发酵时酵母对含硫氨基酸、硫酸盐和亚硫酸盐的同化作用，以及酵母合成蛋氨酸受抑制时的中间产物。两种方法筛选出的低产H2S酵母存在差异，主要原因有两点：一是发酵速度对H2S的生成起决定性的作用，液体培养基和固体培养基的发酵速度必然是液体中更快。二是两种培养基的成分不同产生H2S的代谢途径不同[17]。亚硫酸铋琼脂平板使用于评估固态发酵，含有外源硫元素的发酵条件下H2S产量。醋酸铅试纸法适用于评估液态发酵，有含硫蛋白的发酵条件下H2S的产量。

2.3 10种非酿酒酵母产H2S的动态分析

通过方法1.3.4醋酸铅试纸法分析10种非酿酒酵母产H2S动态，结果如图3所示。由图3可知，P.kudriavzevii、C.tropicalis、C.humillis和P.terricola这些高产H2S的菌株在0～12 h间H2S产量一直呈上升趋势，12h产量达最大，H2S产生量分别为178.70μg/L、81.93μg/L、73.50μg/L、65.74μg/L；C.lusitaniae、T.delbrueckii和H.opuntiae这些低产H2S的菌株在培养12 h后开始产H2S，C.lusitaniae、T.delbrueckii在24 h时产H2S量最大，H.opuntiae在60 h达产H2S量最大，H2S产生量分别为，10.45 μg/L、8.09 μg/L、6.74 μg/L。同时，C.tropicalis、P.terricola、B.californica、C.lusitaniae和T.delbrueckii的H2S动态曲线存在“双峰”现象，且发酵前期的峰值高于发酵后期的峰值，这一现象与王春晓等[18]报道一致，但本研究中第一个峰值出现的时间（12～24 h）比其报道的（88 h）要早，第二个峰值为72 h。酵母产H2S的“双峰”现象可能是由于发酵前期，H2S大多由蛋氨酸产生，随着蛋氨酸含量降低，对硫酸盐代谢的抑制减弱，发酵中后期H2S主要由半胱氨酸或硫酸盐代谢生成[20]。H.occidentalis、H.opuntiae、P.kudriavzevii和C.humillis的H2S动态曲线仅出现单峰，无双峰的出现可能与酵母利用发酵液中氨基酸的情况不同有关。

图310 种非酿酒酵母产H2S的动态分析Fig.3 Dynamic analysis of H2S production conditions from ten non-Saccharomyces

2.4 10种非酿酒酵母产H2S和发酵速率的关系分析

为探究不同酵母产H2S产生速度和发酵速率的关系，本研究通过方法1.3.5分析了10种非酿酒酵母H2S产量和CO2释放量之间的关系，结果如图4所示。

由图4可知，同种非酿酒酵母，其发酵速度和H2S生成速度基本呈正相关。C.tropicalis在0～12 h时的发酵速度最大，H2S生成速度最高；12～36 h发酵速度减慢，H2S生成速度减缓；36 h后发酵速度趋于平缓，H2S生成速度变化很小。P.terricola在0～12 h时的发酵速度最大，H2S生成速度最高；12 h后发酵速度趋于平缓，H2S生成速度变化很小。B.californica在0～12 h时的发酵速度较慢，基本无H2S生成；12～36 h发酵速度最大，H2S生成速度最高；36 h后发酵速度趋于平缓，H2S生成速度在60～72h时出现变化，但变化较小。H.uvarum在0～120 h发酵速度都很平稳，H2S生成速度虽出现变化，但始终较低。H.occidentalis在0～24h时的发酵速度最大，H2S生成速度在12～24 h最高，稍有延迟；24 h后发酵速度趋于平缓，H2S生成速度变化很小。H.opuntiae在0～24 h时的发酵速度最大，但此段时间内无H2S生成，24 h后发酵速度趋于平缓，酵母生成H2S延迟至48 h生成，72 h后；24 h后H2S生成速度基本不变。P.kudriavzevii在0～24 h时的发酵速度最大，H2S生成速度最高；24 h后发酵速度趋于平缓，H2S生成速度基本不变。C.humillis在0～24 h时的发酵速度最大，H2S生成速度最高；24 h后发酵速度趋于平缓，H2S生成速度基本不变。C.lusitaniae在0～24 h时的发酵速度最大，H2S生成速度在12～24 h最高，稍有延迟；24 h后发酵速度趋于平缓，H2S生成速度在60～72 h时出现变化，但变化较小。T.delbrueckii在0～24 h时的发酵速度最大，H2S生成速度在12～24 h最高，稍有延迟；24 h后发酵速度趋于平缓，H2S生成速度在60～72 h时出现变化，但变化较小。发酵前期的H2S主要由蛋氨酸分解产生[19]，在12 h及以后才开始生成H2S的非酿酒酵母可能是由于分解蛋氨酸的相关酶活性低，产生H2S较少。C.lusitaniae的H2S产量（17.53 μg/L）与T.delbrueckii（13.49 μg/L）和H.uvarum的H2S产量（15.51 μg/L）相近，但发酵速度为C.lusitaniae与T.delbrueckii接近，且远大于H.uvarum，CO2的总释放量为T.delbrueckii（14.57 mg/L）＞C.lusitaniae（14.48 mg/L）＞H.uvarum（8.20mg/L），发酵速率与H2S产生基本呈正相关。

图410 种非酿酒酵母发酵速度和H2S产生的关系分析Fig.4 Relationship between fermentation rate and H2S producing speed of ten non-Saccharomyces

3 结论

亚硫酸铋平板法筛选出的低产H2S酵母为C.tropicalis、H.occidentalis、H.uvarum、C.lusitaniae、T.delbrueckii；醋酸铅试纸法筛选出的低产H2S酵母为C.lusitaniae、H.uvarum、T.delbrueckii和H.opuntiae；在对酵母产H2S能力进行评价时，培养72 h基本可确定酵母的H2S产量，并且对于同一种酵母，发酵速度越快，产H2S越多，因此较慢的发酵速度有利于减少H2S的生成，避免H2S对果酒带来的不良影响。为了控制H2S的生成量，尽量减少或控制发酵液中与H2S产生相关的含硫氨基酸、硫酸盐和亚硫酸盐的量，如果不同批次原料中含硫氨基酸量一致，就可以有效地控制H2S的生成量。H2S产生情况、动态以及与发酵速度的关系分析结果，将为该酵母在实际生产中的应用提供参考价值，但酵母在实际生产条件下的H2S的产生情况，需要进一步进行分析。

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H2S production capacity and dynamics analysis of 10 non-Saccharomyces

WANG Youbei1,2,XIAO Feng1,2,JI Xueao1,2,CHEN Fusheng1,2,ZHANG Xiuyan1*
(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 2.Key Laboratory of Environment Correlative Dietology,Ministry of Education,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

In order to analyze the relationship between H2S production dynamics and fermentation rate of 10 non-Saccharomyces,comparative analysis of H2S production capacity of 10 non-Saccharomyceswas carried out on the bismuth sulfite agar medium and in the yeast extract peptone dextrose medium,respectively.Furthermore,their H2S production dynamic analysis and the relativity with their fermentation speed were analyzed in YPD liquid medium.The results indicated that seven non-Saccharomycesspecies could produce H2S on the bismuth sulfite agar medium.However,all 10 non-Saccharomycesspecies could produce H2S in YPD liquid medium with different producing capacities.Additionally,their H2S production capacities were positively correlative with fermentation speeds.Those results will provide references for the application of non-Saccharomyces,and for the screening of other non-Saccharomycesstrains or other microorganisms.

non-Saccharomyces;H2S;lead acetate test paper method;bismuth sulfite agar method

TS261.1

0254-5071（2017）06-0023-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.005

2016-10-02

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2662015PY068）；宁夏回族自治区重点研发项目重大项目(2016BZ06)；国家自然科学基金资助（31071588）

王优蓓（1994-），女，本科生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：张秀艳（1973-），女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。