基于高通量测序的一个非综合征型耳聋家系遗传性分析

赵胜瑜 耿曼英△ 王利利 汤文学 赵九州 王志中 张 慧 郭景玉

1)郑州大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科 郑州 450014 2)郑州大学附属肿瘤医院分子病理实验室 郑州 450000

基于高通量测序的一个非综合征型耳聋家系遗传性分析

赵胜瑜1)耿曼英1)△王利利1)汤文学1)赵九州2)王志中2 )张 慧1)郭景玉1)

1)郑州大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科 郑州 450014 2)郑州大学附属肿瘤医院分子病理实验室 郑州 450000

目的 采用高通量测序方法对一个非综合征型耳聋(non-syndromic hearing loss，NSHL)家系进行基因测序，探讨该家系的分子遗传学机制。方法 调查该耳聋家系成员的病史并进行相应检查，抽取外周血并提取DNA，用高通量测序方法对129个已知的与综合征型耳聋及非综合征型耳聋相关的基因进行测序，经计算机分析系统进行碱基读取，获得DNA序列。结果 该非综合征型耳聋家系中3例患者均携带GJB3 c.375C>T杂合突变、KCNQ4 c.777T>C杂合突变、ILDR1 c.1545T>G纯合突变、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T纯合突变、线粒体DNA m.1121T>C突变，Ⅱ6携带ILDR1 c.1545T>G杂合突变、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T纯合突变，Ⅰ3携带GJB2 c.1277C>T纯合突变，Ⅱ3、Ⅱ7、Ⅱ11均携带GJB2 c.1277C>T杂合突变。结论 该非综合征型耳聋家系的致病基因可能为线粒体DNA m.1121T>C突变，也可能为GJB2与GJB3双基因致聋。

非综合征型耳聋；高通量测序；遗传分析

耳聋作为最常见的感觉缺陷性疾病之一为人类所熟知，新生儿中听力损失≥40 dB HL的发病率为1∶1 000，且有约相同数目的儿童在成长过程中发展为耳聋[1]。2006年我国第2次残疾人抽样调查显示；听力言语残疾者达2 780万人，居各类残疾之首[2]。耳聋的病因可归纳为遗传和环境两大类，遗传性因素占60%以上，其中70%以上属于非综合征型耳聋(non-syndromic hearing loss，NSHL)[3]。根据遗传方式的不同可将遗传性耳聋分为以下4种：常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、性染色体连锁(X连锁隐性遗传和Y-连锁遗传)及线粒体突变母系遗传[4]。NSHL通常为感音神经性聋，15%～20%为常染色体显性聋，80%为常染色体隐性聋，1%为X-连锁耳聋，而线粒体性聋不足1%[5]。线粒体DNA(mitochondria DNA，mtDNA)突变率高，损伤修复能力较差，且mtDNA突变与临床多种疾病相关，因此吸引众多学者对mtDNA突变所导致耳聋的研究。本研究应用高通量测序方法对一个NSHL家系进行129个已知的与耳聋相关的基因(http：//www.otogenetics.com)测序，结果显示，该NSHL家系成员携带多种基因的同义突变，而3例患者除携带有多种常见突变外，还携带mtDNA m.1121T>C，考虑mtDNA m.1121T>C可能为致病基因，或其耳聋为多基因联合致病。

1 资料与方法

1．1 临床资料 收集来自河南南阳市的1个NSHL家系，绘制家系图(图1)。本研究所采集信息及血样均征得患者及家属同意并签署知情同意书。所有纳入研究的人员均填写基本信息登记表，详细调查耳聋患者的发病年龄、诱发因素、伴随症状、耳聋的进展情况、有无耳毒性药物应用史、头部或耳部外伤史、噪声接触史、母亲孕育情况及新生儿黄疸史等。所有纳入研究的人员均进行相应检查，包括纯音测听、声导抗、耳声发射、听性脑干反应、听觉诱发电位、颞骨CT、头颅MRI、内听道水成像等，排除颅脑占位性病变及智力障碍。

图1 耳聋家系主要成员

1．2 研究方法

1．2．1 标本采集：采集所有纳入研究人员的外周静脉血5 mL，EDTA-K2抗凝。

1．2．2 DNA提取：应用DNA提取试剂盒(购自苏州云泰生物医药科技有限公司)提取DNA，提取方法及步骤严格参照试剂盒提供的说明书进行，Qubit dsDNA HS定量待建库样本，样本纯度A(260 nm/280 nm)为1.7～2.0，调整投入量/投入体积至80 ng/2 μL。 保存于-20 ℃冰箱备用。

1．2．3 DNA文库建立：将样本基因组DNA随机打断成200～300 bp的DNA片段，在所获得的DNA片段两端分别接上已知序列的接头构建杂交文库。纯化后进行PCR富集(PCR反应体系及反应程序分别见表1、表2)，将降至室温的DNA反应产物再次进行纯化。Qubit dsDNA HS准确定量所获得的文库总量，总量500～750 ng。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应程序

1．2．4 杂交捕获：将文库DNA与杂交探针(杂交探针试剂配制见表3，由Otogenetics corporation提供)混匀在PCR仪上反应后用带有链霉素的磁珠捕获，经洗涤后在DNA片段两端添加已知序列的Index(由Otogenetics corporation提供)，经PCR扩增后纯化得到双Index文库。Qubit dsDNA HS法准确定量所获得的双Index文库。

表3 杂交探针试剂配制

1．2．5 上机测序：稀释文库DNA至8 pM，加入已准备好的Flow cell中，应用Illumina next 500平台测序。

1．2．6 碱基读取：原始图像文件经计算机分析系统进行碱基读取，获得DNA序列。 以上实验过程均在郑州大学附属肿瘤医院分子病理实验室完成。

2 结果

2．1 病史及听力学检查 本研究中所收集的耳聋家系来自河南省南阳市，先证者Ⅱ548岁，无言语能力，5岁时无明显诱因突发双耳听力下降，现已发展为极重度感音神经性耳聋，纯音测听结果示，双耳极重度感音神经性耳聋，声导抗无异常，耳声发射双耳未通过。患者Ⅲ44岁，Ⅲ52岁，家长发现患儿8月龄时对声音无反应就诊，Ⅲ4听觉诱发电位示V波阈值：左耳100 dB，右耳95 dB。Ⅲ5听觉诱发电位示V波阈值：双耳均为95 dB。二者耳声发射双耳均未通过。余成员相关听力学检查未见异常。所有成员均否认头部及耳部外伤史、耳毒性药物应用史、噪声接触史、新生儿黄疸。

2．2 影像学检查 所有家系成员颞骨CT、头颅MRI、内听道水成像均未见颅内占位、外耳、中耳、内耳等结构异常表现。

2．3 基因检测 测序结果与http：//genome.ucsc.edu/，参考版本GRch37/hg19进行比对后发现3例患者均携带GJB3 c.375C>T杂合突变、KCNQ4 c.777T>C杂合突变、ILDR1 c.1545T>G纯合突变、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T纯合突变、mtDNA m.1121T>C突变，Ⅱ6携带ILDR1 c.1545T>G杂合突变、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T纯合突变，Ⅰ3携带GJB2 c.1277C>T纯合突变，Ⅱ3、Ⅱ7、Ⅱ11均携带GJB2 c.1277C>T杂合突变。

3 讨论

根据图1及遗传规律分析该家系的遗传方式可能为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或线粒体突变母系遗传，因此，基因分析对于明确该家系的致病基因、确定遗传方式至关重要。目前已知的与耳聋相关的基因数目多达100余种，常用的基因检测方法有Sanger测序、基因芯片测序、高通量测序。Sanger测序被认为是诊断基因突变的金标准，准确性高，能提供被检测基因的全部序列信息，但无法同时检测多个基因多个突变位点，存在成本高、耗时长等缺点。基因芯片测序法可以同时检测多个基因，但目前已开发的遗传性聋基因诊断芯片，仅能同时检测个别常见耳聋基因中的突变，无法检测少见或未知的突变，存在漏诊风险。高通量测序具有快速、准确、灵敏、高效、覆盖度广等特点[6-7]。因此，我们选择高通量测序方法，并应用美国Otogenetics corporation的试剂盒，该试剂盒可对129个已知的与综合征型耳聋及非综合征型耳聋相关的基因进行测序。

国内大规模耳聋分子流行病学研究显示，国人非综合型耳聋多由GJB2、SLC26A4、12SrRNA、GJB3等基因突变引起[8]。该家系成员除携带有常见的GJB2、GJB3突变外，还发现有KCNQ4、ILDR1及mtDNA突变，未发现SLC26A4突变。根据https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/网站数据可知GJB3 c.375C>T、KCNQ4 c.777T>C、ILDR1 c.1545T>G、GJB2 c.1277C>T、c.1152G>A及c.1067G>T均为同义突变，碱基发生改变后所翻译的氨基酸未发生改变，因此，以上基因不存在单独致病性。mtDNA m.1121T>C未见报道。

Liu等[9]曾提出GJB2基因与GJB3基因可能以双基因模式遗传共同致聋的观点，他们认为GJB2与GJB3虽不在同一染色体上，但都编码缝隙连接蛋白，在内耳离子平衡中发挥重要作用，但具体机制尚未明确。本研究中发现除3例患者同时携带GJB2和GJB3突变基因外，其余家系成员不携带或只携带单一基因突变，因此，该家系有可能为GJB2与GJB3双基因共同致聋，具体机制有待进一步研究。

线粒体DNA突变是导致耳聋的重要原因之一。目前研究明确的有mtDNA m.1555A>G突变及m.1494C>T突变，此突变位于线粒体核糖体小亚基(12SrRNA)的氨基酸结合位，也是氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside antibiotics，Aman)的作用位点，突变后12SrRNA更易结合Aman，导致耳聋的发生[4]。此外，Lu等[10]研究发现了其他可能与Aman相关的突变位点，包括mtDNA m.745A>G、m.792C>T、m.801A>G、m.839A>G、m.856A>G、m.1027A>G、m.1192C>T、m.1310C>T、m.1331A>G、m.1374A>G、m.1452T>C等，这些突变位点均位于线粒体12SrRNA高度保守的核苷酸上，且在449个正常对照者中未出现以上突变。

本研究发现，3例耳聋患者携带mtDNA m.1121 T>C突变，该位点位于线粒体12S rRNA高度保守的核苷酸上，与Lu等[10]发现的m.1027A>G、m.1192C>T相邻，且在同一功能区，因此该位点可能是与Aman相关的突变位点。虽该家系否认有Aman应用史，但Guan[11]及Goto等[12]的研究显示，在未应用Aman的家系中也可能出现迟发性或渐进性耳聋，使用Aman后可诱发或加重耳聋表现。因此，我们推测mtDNA m.1121T>C突变可能为该家系的致病基因。但其机制并不明确，需更为广泛和深入的研究。我们的团队将继续跟踪调查该NSHL家系，并深入研究mtDNA m.1121T>C突变引起耳聋的具体致病机制。

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[4] 张雪溪，张杰，陈敏，等．线粒体DNA突变与遗传性耳聋[J]．中华耳科学杂志，2015，13(3)：454-457．

[5] 代志瑶，戴朴．非综合征型耳聋的基因型与表型关系[J]．中华耳科学杂志，2013，11(1)：151-155．

[6] 袁永一，戴朴．遗传性聋的精准医疗[J]．临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2016，30(1)：1-5．

[7] 刘莉扬，张学工．高通量测序技术在临床医学中的应用进展[J]．医学综述，2013，19(16)：2 971-2 973．

[8] 王国建，戴朴，韩东一，等．基因芯片技术在非综合征性耳聋快速基因诊断中的应用研究[J]．中华耳科学杂志，2008，6(1)：61-66．

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[10] Lu J，Li Z，Zhu Y，et al．Mitochondrial 12S rRNA variants in 1642 Han Chinese pediatric subjects with aminoglycoside-induced and nonsyndromic hearing loss[J]．Mitochondrion，2010，10(4)：380-390．

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[12] Goto Y，Nonaka I，Horai S．A mutation in the tRNA(Leu)(UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies[J]．Nature，1990，348(6 302)：651-653．

(收稿2017-01-12)

河南省科技攻关计划普通项目(No：20130384)

R764.43

A

1673-5110(2017)10-0044-03

△通讯作者：耿曼英，E-mail：manying66@126.com