穿山龙多糖影响NADPH氧化酶/ROS信号通路抗H2O2诱导的HUVECs细胞损伤作用研究

张晓雪，孙慧君，李士军，王长远，单新辉，周晓琳，金 越

(1.大连医科大学 药理教研室，辽宁 大连 116044；2.大连医科大学 临床药理教研室，辽宁 大连 116044；3.大连医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 大连 116011；4.大连市结核病医院 药剂科，辽宁 大连 116034；5.大连市甘井子区卫生监督所，辽宁 大连 116034)



论 著

穿山龙多糖影响NADPH氧化酶/ROS信号通路抗H2O2诱导的HUVECs细胞损伤作用研究

张晓雪1，孙慧君2，李士军3，王长远2，单新辉4，周晓琳5，金 越1

(1.大连医科大学 药理教研室，辽宁 大连 116044；2.大连医科大学 临床药理教研室，辽宁 大连 116044；3.大连医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 大连 116011；4.大连市结核病医院 药剂科，辽宁 大连 116034；5.大连市甘井子区卫生监督所，辽宁 大连 116034)

目的 检测穿山龙多糖(RDNP)是否可以通过影响NADPH氧化酶/ROS信号通路对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化损伤产生保护作用。方法 H2O2作用HUVECs 4 h造成损伤，分别给予25、50、100、200、400、800 μg/mL RDNP进行干预，选取适当浓度进行后续实验。采用MTT法测定细胞活力；试剂盒检测 LDH、MDA、SOD、T-AOC、GSH-Px、ROS水平；Western Bolt及 qRT-PCR法检测Nox4、p22phox的蛋白及mRNA表达。结果 加入50、100和200 μg/mL浓度的RDNP与H2O2模型组间相比，活力增加，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。因此选择50、100、200 μg/mL RDNP剂量组进行实验。不同浓度RDNP均可以显著改善H2O2损伤，使细胞形态逐渐趋于正常，以200 μg/mL RDNP给药组的效果最为显著。RDNP可以降低H2O2损伤HUVECs模型中LDH、MDA及ROS的水平，并增强细胞内SOD、 GSH-Px、T-AOC活力；且从mRNA水平及蛋白水平抑制Nox4、p22phox的表达。结论 RDNP可以通过干扰NADPH氧化酶/ROS信号通路抑制H2O2造成的HUVECs氧化损伤，保护内皮细胞。

穿山龙多糖；Nox4；ROS；p22phox；动脉粥样硬化

近年来，越来越多的研究证实，从早期炎症细胞迁移到血管壁脂肪纹的形成、晚期血管细胞活化以及更复杂的病变发展，动脉粥样硬化的发生与发展，均与血管内皮发生氧化应激密切相关[1]。中药多糖可以通过降低炎症和氧化应激反应及血清脂质水平抗动脉粥样硬化，且具有副作用小的特点[2-3]。穿山龙(Rhizoma Dioscoreae Nipponicae)是一类传统的中药[3]。有研究表明，穿山龙多糖(Rhizoma Dioscoreae Nipponicae polysaccharides，RDNP)可以降低大鼠血糖、中性脂质和总胆固醇水平，清除羟基自由基[4]，其可能具有抗氧化损伤及防治动脉粥样硬化的作用。但对于RDNP抗氧化应激作用机制的文献报道比较少。因此，本实验旨在研究穿山龙多糖(RDNP)是否可以通过影响NADPH氧化酶/ROS信号通路对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化损伤产生保护作用，为穿山龙多糖作为抗动脉粥样硬化的新药开发提供理论基础及依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和抗体

穿山龙购自千草园医药科技开发有限公司，RDNP由水提醇沉法粗提取，Sevag法和木瓜蛋白酶法去除蛋白，用DEAE-52纤维柱及Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析法进行进一步纯化，苯酚-硫酸法检测穿山龙多糖粗提物中的糖成分，最后用高效液相色谱法鉴定穿山龙多糖的纯度，本实验使用的RDNP经鉴定纯度在95%以上。

DMEM购自Gibco-BRL公司；Nox4抗体购自Proteintech生物技术公司；p22phox、GAPDH抗体购自Santa Cruz生物技术公司；活性氧测试试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培养液， 37 ℃，5%CO2孵箱中培养。

1.3 MTT测定细胞存活率

将HUVECs细胞按每孔1×105的密度接种于96孔板中培养，过夜，分别给予0(空白对照组)、25、50、100、200、400、800 μg/mL RDNP，培养12 h后，每孔中加入10 μL MTT(5 mg/mL)溶液，培养板于37 ℃孵育4 h。弃上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解结晶，最后用全自动酶标仪于波长490 nm处测定吸光度值。每组设定6个平行孔，细胞存活率按公式计算：细胞存活率(%)=实验组(OD)/空白组(OD)×100%。根据实验结果，选取25、50、100、200μg/mLRDNP及50 μg/mL维生素C(VC)，培养12 h后，加入500 μmol/L H2O2继续培养4 h。MTT法检测细胞活力及细胞存活率，计算方法同上。

1.4 光学显微镜观察

HUVECs细胞按每孔2×105的密度接种于6孔板中培养12 h，分别给予50、100、200 μg/mL RDNP和50 μg/mL维生素C(VC)，12 h后，加入500 μmol/L H2O2孵育4 h，用OLYMPUS CKX41 倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

1.5 MDA、LDH、SOD、T-AOC及GSH-Px水平检测

细胞铺板及给药同上，造模结束后按试剂盒说明测定MDA、LDH、SOD、T-AOC及GSH-Px水平。

1.6 ROS水平测定

细胞造模及给药同上，结束后，细胞用胰蛋白酶处理，PBS清洗后，加入10 mmol/L DCFH-DA于37 ℃孵育30 min。PBS清洗2次后，用BD FACSCalibur流式细胞仪进行分析。

1.7 免疫印迹

将HUVECs细胞浆与细胞核进行分离，具体操作方法按照核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)说明书进行操作。用10%、12%及15% SDS-PAGE凝胶进行电泳。

1.8 RNA提取和qRT-PCR

用RNAiso plus(大连宝生物工程有限公司)提取总RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(大连宝生物工程有限公司)将RNA反转录合成cDNA，进行扩增与检测，每个样品设3个平行复孔，β-Actin作为内参基因，用2-△△ct的方法求得各个目的基因的相对含量。

所用引物的序列如下：

Nox4： 正向引物 5'-GCTGCATCAGTCTTAACCGAAC-3'；反向引物5'-GGCTCTTCCATACAAATCTTCAA-3'；

p22phox：正向引物5'-CAGTGGTACTTTGGTGCCTACTCC-3'；反向引物5'-GGTGGAGCCCTTCTTCCTCT-3'；

β-actin： 正向引物：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'；反向引物：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

1.9 统计学方法

采用SPSS19.0 软件进行统计分析。数据均用Tukey检验法进行单向方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTT法确定RDNP的作用浓度

如图1所示，400及800 μg/mL RDNP与细胞共培养12 h，发现细胞活力有所下降，考虑为药物浓度过大所致，因此设定RDNP给药组的最大浓度为200 μg/mL。如图2所示，用500 μmol/L H2O2处理后，HUVECs细胞活力显著下降，同时加入50、100和200 μg/mL浓度的RDNP与H2O2模型组间相比，活力增加，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。但25 μg/mL剂量组与H2O2模型组间无明显差异。因此我们选择50、100、200 μg/mL RDNP剂量组进行实验。

A:空白对照组；B:25 μg/mL RDNP组；C:50 μg/mL RDNP组；D:100 μg/mL RDNP组；E:200 μg/mL RDNP组；F:400 μg/mL RDNP组; G:800 μg/mL RDNP组。## 与空白对照组比较，P<0.01图1 MTT法测定细胞存活率Fig 1 Cell viability of HUVECs detected by MTT

A:空白对照组；B：500 μmol/L H2O2组；C：25 μg/mL RDNP组；D:50 μg/mL RDNP组；E:100 μg/mL RDNP组；F:200 μg/mL RDNP组；G:50 μg/mL VC组。**P< 0.01 vs.空白对照组，#P< 0.05 vs. H2O2组，##P < 0.01 vs. H2O2组图2 MTT法测定细胞存活率Fig 2 Cell viability of HUVECs detected by MTT

2.2 RDNP对H2O2诱导HUVECs细胞损伤形态学变化的保护作用

在光学显微镜下，用400×放大倍数，观察HUVECs细胞的形态学变化。正常组细胞呈多边形，可见典型的鹅卵石样外观，细胞与培养板之间及各个细胞间连接紧密，细胞界限清晰(图3A)。而H2O2损伤模型组细胞表现出异常的形态变化，包括细胞变圆、肿胀，部分细胞从板底脱落等(图3B)。而不同浓度RDNP及VC给药组均可以显著改善其损伤，使细胞形态逐渐趋于正常，以200 μg/mL RDNP给药组的效果最为显著，可见大面积正常细胞，仅有少数几个细胞状态异常。

2.3 RDNP对H2O2损伤HUVECs细胞LDH、MDA水平及SOD、T-AOC及GSH-Px水平的影响

H2O2处理过4 h的HUVECs细胞中，MDA和LDH含量显著增加(图4A，B)，SOD、T-AOC及GSH-Px活性显著降低(图4C-E)。给予RDNP治疗后，可以剂量依赖性降低受损细胞中LDH和MDA含量，升高细胞中SOD、T-AOC及GSH-Px水平。

2.4 RDNP对H2O2损伤HUVECs细胞中ROS生成的影响

H2O2诱导2 h后，ROS含量(561.35±11.40)与空白对照组(272.17±15.79)相比显著升高(图5C，B)。低中高剂量组RDNP可以剂量依赖性的降低ROS水平(荧光强度均值分别为523.99±7.41，505.85±18.08，386.70±22.98)(图5D-F)。VC给药组的平均荧光强度为310.89±31.53(图5G)。

2.5 RDNP对H2O2诱导HUVECs细胞损伤模型中Nox4与p22phox过表达的影响

在H2O2模型组中，Nox4与p22phox的mRNA表达量均显著增加。200 μg/mL RDNP给药组Nox4与p22phox mRNA过表达均被显著抑制(图6A、B)。蛋白的表达水平变化也与mRNA表达结果相一致。H2O2模型组中Nox4与p22phox蛋白表达量高于空白对照组2倍，而RDNP给药组呈剂量依赖性的降低Nox4与p22phox蛋白表达(图6C、D)。

3 讨 论

氧化应激是指机体或细胞内氧自由基的产生与消除失衡，或外源性氧化物质的过量摄入，导致ROS在体内或细胞内蓄积而引起的细胞毒性过程[5]。近年来的大量研究揭示，氧化应激在AS性疾病的发生、发展，到最终临床事件的全过程中，都扮演着重要角色[6]。

A：空白对照组；B：H2O2组；C：50 μg/mL RDNP组；D：100 μg/mL RDNP组；E：200 μg/mL RDNP组；F：50 μg/mL VC组图3 RDNP对H2O2诱导HUVECs细胞损伤形态学变化的保护作用Fig 3 Effect of RDNP on inhibiting the morphology changes induced by H2O2 in HUVECs(×400)

A：MDA含量；B：LDH含量；C：SOD活性；D：T-AOC活性；E：GSH-Px活性；**P< 0.01 vs.空白对照组，#P< 0.05 vs. H2O2组，##P< 0.01 vs. H2O2组图4 RDNP对H2O2损伤HUVECs细胞MDA、LDH水平及细胞内SOD、GSH-Px、T-AOC活性的影响Fig 4 Effect of RDNP on MDA, LDH levels and intracellular SOD, GSH-Px, T-AOC activities induced by H2O2 in HUVECs

穿山龙为活血舒筋、祛风止痛的常用药[7]。近年来，穿山龙里面的有效成分之一薯蓣皂苷一直是研究的热点，而在提取薯蓣皂苷的过程中，多糖是作为杂质成分被摒弃掉的。可能是由于这个原因，目前国内外关于穿山龙多糖的研究比较少见。我们利用H2O2造成HUVECs损伤模型，产生细胞氧化应激循环及模拟血管中发生的ROS损伤血管内皮细胞所启动的AS反应。结果显示，在RDNP给药组中，SOD、GSH-Px和T-AOC水平增高，MDA和LDH水平降低，说明RDNP通过保护重要的抗氧化酶体系，来减少细胞损伤，从而达到增强HUVECs细胞抗自由基活性的作用。

A：阴性对照组；B：空白对照组；C：H2O2组；D：50 μg/mL RDNP组；E：100 μg/mL RDNP组；F：200 μg/mL RDNP组；G：50 μg/mL VC组；H：各组ROS水平。**P< 0.01 vs.空白对照组；#P< 0.05 vs. H2O2组；##P< 0.01 vs. H2O2组图5 RDNP对HUVECs细胞中ROS的影响Fig 5 Effect of RDNP on ROS generation induced by H2O2 in HUVECs

A：p22phox mRNA表达；B：Nox4 mRNA表达；C：p22phox蛋白表达；D：Nox4蛋白表达；**P< 0.01 vs.空白对照组，#P<0.05 vs. H2O2组，## P< 0.01 vs. H2O2组图6 RDNP对H2O2损伤HUVECs细胞中Nox4与p22phox表达的影响Fig 6 Effect of RDNP on Nox4 and p22phox expressions induced by H2O2 in HUVECs

NADPH氧化酶目前被认为是血管内生成ROS的主要酶复合体，其催化亚基Nox1-5，DUOX1 和DUOX2 被称为Nox 家族[8]。Nox 家族蛋白主要的生物学功能是产生ROS，维持细胞的正常生理活动[9]，但在异常状态下，Nox蛋白过表达则可以产生大量的ROS，促进动脉粥样硬化发生。Nox4是NOX中唯一在血管细胞中有高表达且可以促进生成H2O2的一个亚型，在HUVECs细胞中， Nox4是ROS的主要来源[10]。p22phox是NADPH氧化酶中一个重要的组成成分，有活化NADPH氧化酶的作用[11]。经研究发现，在有AS 病灶的冠脉，p22phox 呈强表达[12]，在我们的实验中，发现RDNP可以显著降低HUVECs细胞中ROS水平，说明RDNP可能通过抑制NADPH氧化酶的活性发挥抗氧化作用。而RDNP给药组与H2O2损伤组相比，细胞中Nox4和p22phox mRNA水平及蛋白水平呈现出剂量依赖性的降低，证实了我们的推断。说明RDNP可以影响NADPH氧化酶对H2O2损伤的HUVECs细胞产生保护作用。

我们的研究可为RDNP作为抗动脉粥样硬化的新药开发提供一定的理论依据。由于多糖成分复杂，已有大量实验证实植物多糖除了具有抗氧化作用之外，还可通过抗炎、降脂等方向改善血管功能，防治AS的发生及发展。因此，我们推测RDNP可能通过影响NADPH氧化酶/ROS信号通路进而调控炎症信号通路、脂肪代谢信号通路、凋亡信号通路等多条通路抗AS，其具体机制仍需进一步的研究和探讨。

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医学术语使用规范

医学术语应全文统一，不要一义多词或一词多义。妇产科学、耳鼻咽喉科学、血液病学、呼吸病学、内分泌学、眼科学和外科学的名词已由医学名词审定委员会审定公布，应严格执行。其他尚未审定者，目前以下列两个主题词索引为准：(1)《医学主题词注释字顺表(1992年版)中文索引》(中国医学科学院医学信息研究所，1992)；(2)《中医药主题词表》(中国中医研究院图书情报研究所，1987)。在这两个主题词表中找不到者，则以人民卫生出版社出版的《英汉医学词汇》、化学工业出版社出版的《药名词汇》和科学出版社出版的各学科名词审定本为准。国内尚无统一译名的，参考以上词典慎重拟定，并在译名后加括号标注外文；在医学名词审定委员会正式公布后，应立即严格遵照执行。中文药物名称应使用其化学名，不用商品名。

Rhizoma Dioscoreae Nipponicae polysaccharides protective effect onH2O2-induced HUVECs injury model by interfering NADPH oxidase/ROS pathway

ZHANG Xiaoxue1, SUN Huijun2, LI Shijun3, WANG Changyuan2, SHAN Xinhui4, ZHOU Xiaolin5, JIN Yue1

(1.DepartmentofPharmacology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DepartmentofClinicalPharmacology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 3.DepartmentofClinicalLaborator,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 4.DepartmentofPharmacy,DalianMunicipalTuberculosisHospital,Dalian116034,China; 5.InstituteofHealthInspection,GanjingziDistrictofDalian,Dalian116034,China)

Objective To investigate effect of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae polysaccharides (RDNP) on protecting HUVECs from H2O2-induced injury by interfering NADPH oxidase/ROS pathway. Methods HUVECs were treated with RDNP in the presence/absence of H2O2for 4 h. Then cell activity was detected by MTT method. LDH, MDA, SOD, T-AOC, GSH-Px and ROS were detected by reagent kits to evaluate the cell injuries and the antioxidant activity. Western blot and qRT-PCR was used to evaluate the protein expression and the mRNA expression of Nox4, p22phox. Results LDH, MDA, ROS levels decreased and intracellular SOD, T-AOC as well as GSH-Px activities enhanced in H2O2-treated HUVECs when RDNP was used, especially with 200 μg/mL. Simultaneously, Nox4, p22phox expression were both decreased in protein and mRNA levels in HUVECs. Conclusions RDNP could protect HUVECs from H2O2-induced injury by interfering NADPH oxidase/ROS pathway.

Rhizoma Dioscoreae Nipponicae polysaccharides (RDNP); Nox4; ROS; p22phox; atherosclerosis

国家自然科学基金项目(81273508)；辽宁省教育厅基金项目(L2011153)

张晓雪(1990-)，女，硕士研究生。E-mail：m15040555883@163.com

金 越，副教授。E-mail：rutin@sina.com

10.11724/jdmu.2017.03.02

R966

A

1671-7295(2017)03-0214-06

张晓雪，孙慧君，李士军，等.穿山龙多糖影响NADPH氧化酶/ROS信号通路抗H2O2诱导的HUVECs细胞损伤作用研究[J].大连医科大学学报，2017,39(3)：214-219.

2016-12-26；

2017-03-22)