血性胸水细胞蜡块制作的体会

林 旭,周 强

(南京大学附属鼓楼医院病理科，江苏 南京 210008)

临床细胞病理工作中，常规的胸水涂片因制作简单、可快速进行诊断在临床应用普及。但是日常工作中，胸水涂片经常因细胞形态结构不典型、细胞蜕变、或与增生间皮细胞不易区分等因素，细胞病理学并不能有明确的诊断结果[1]。通过制作细胞蜡块，进行免疫组织化学方法鉴别，才能使细胞病理诊断精准化。然而，细胞蜡块的制作要求严格，特别是血性胸水，如果标本前期血细胞处理不好，含血量多，就会影响细胞蜡块制作、导致常规石蜡切片严重掉片，从而无法进行更深层次检测诊断。本实验欲研究一种方便快捷的方法，提高血性胸水细胞蜡块的制作质量，从而方便免疫组织化学、分子等检测，使细胞病理诊断趋于精准化。

1 资料与方法

1.1 一般资料

南京大学附属鼓楼医院病理科2013—2015年临床2 h内送检新鲜血性胸水20例，容量大于200 mL。

1.2 试剂

95%乙醇、PreservCyt细胞清洗液(Hologic ,Inc.)、冰醋酸、试管、全自动脱水机(SAKURA)、包埋机(SAKURA)、全自动染色机(Dako CoverStainer)、切片机(Leica)、离心机、振荡器。

1.3 方法

2 h内送检新鲜血性胸水样本，混合均匀后倒入2支试管并配平,2000 r/min离心5 min，弃上清后再倒入混匀样本2 000r/min离心5min，反复多次至标本全部离心完；弃上清、吸取中间层细胞入干净试管，加入20 mL混合液(PreservCyt细胞清洗液与冰醋酸9∶1配比)振荡10 min，2000 r/min离心5 min后弃上清(如果标本含血细胞多，可重复此步骤一次)，将沉淀物平均分成3份，加入20 mL 95%乙醇2 000 r/min离心5 min，分别静置2 h、4 h、过夜等不同时间固定细胞；固定完成后弃上清(95%乙醇)，用擦镜纸将沉淀物包好后放入包埋盒，经全自动脱水机脱水、包埋、常规切片(2 μm)、全自动染色封片机HE 染色封片，镜下观察。

1.4 统计学方法

计算95%乙醇固定的三种时间做出的细胞蜡块个数率，采用SPSS17.0统计软件进行分析，组间比较行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

95%乙醇固定的三种时间做出的细胞蜡块个数率，经SPSS17.0统计软件进行分析，组间比较行χ2检验(P>0.05)，三种不同时间做出的细胞蜡块个数之间并无统计学意义。见表1。

表1 95%乙醇固定的三种时间做出的细胞蜡块个数率比较 例

95%乙醇固定的三种时间做出的细胞蜡块及HE切片外观，可见2 h组获取的细胞量少、细胞沉淀不成形，易松散；4 h组与过夜组的细胞量多，细胞沉淀紧凑成团。见图1、图2。

注：从左到右为2 h组、4 h组、过夜组。图1 95%乙醇固定三种时间的血性胸水细胞蜡块外观

注：从左到右为2 h组、4 h组、过夜组。图2 95%乙醇固定三种时间的血性胸水细胞蜡块HE切片外观

95%乙醇固定三种时间的血性胸水细胞蜡块切片镜下结果显示，背景干净，并无血细胞等影响因素，细胞结构清晰，染色分明，三组间并无明显差别。见图3。

图3 95%乙醇固定三种时间的血性胸水细胞蜡块切片(HE ×200)

3 讨论

细胞蜡块可以永久保存，重复多次制片，多项实验表明细胞蜡块可以进行免疫组织化学、分子检测、原位杂交、提取DNA、RNA对疾病进行深入研究等等[2-3]，在临床应用越来越广。但细胞蜡块制作的效果是成败的关键因素，尤其是血性标本，前期红细胞处理不好，切片时掉片，无法常规切片HE染色镜下诊断，更别提做免疫组化等进一步鉴别检测了。目前，研究主要是采用明胶海绵法、琼脂法、蛋清法、血浆凝固法等[4-7]制作细胞蜡块，这些方法制作有试剂种类多、花费大、步骤繁琐、用时长等不足之处；本实验结合科室的实际情况，寻找一种简捷、高效、价廉的方法，研究结果表明选取4h固定的细胞方法制作的血性胸水细胞蜡块效果好，细胞量多、制片完整，细胞结构清晰、背景干净，能满足于免疫组织化学、分子等各项检测条件。

首先，95%乙醇固定的三种时间做出的细胞蜡块个数率比较，虽然差异并无统计学意义，但从实验过程中得出，95%乙醇固定2 h组的，沉淀物并不完全成形、松散、易碎，黏附于试管壁，并不能最大程度获得样本量；4 h组与过夜组的沉淀物成形，可以完整取出，获得最多样本量；图1、图2切片外观结果显示的就是2 h组的沉淀物松散不成团，而4 h和过夜组的紧凑成团；镜下结果三组间并无明显差别，背景干净，并无血细胞等影响因素，细胞结构清晰，染色分明。因此综合时间及制作效果考虑，固定4 h为最佳状态，过夜则耗时太长。

我们在处理血性胸水时，标本全部离心，尽可能多的获取诊断细胞，满足各种检测所需的细胞量。其次，关键步骤就是对红细胞进行处理。血性胸水含大量红细胞，切片时标本会掉片；且诊断意义的细胞被大量红细胞包裹覆盖，结构模糊、不易识别诊断、影响免疫组织化学结果等等；已有研究表明冰醋酸可高效清洗红细胞及细胞碎片[8]，结合本科室膜式液基薄层细胞技术制片时清洗红细胞的方法，用冰醋酸与PreservCyt细胞清洗液的混合液(1∶9)与沉淀细胞混合、充分震荡接触处理溶解红细胞，离心后弃上清(可重复一次)。此步骤去除红细胞等干扰因素后，镜下结果显示诊断意义细胞结构清晰、背景干净、无红细胞包裹、覆盖等干扰背景，最大程度的获取更多诊断意义的细胞，这样有利于更进一步的免疫分子检测。

再次，95%乙醇是专门固定细胞学标本的固定剂，有固定兼脱水作用；而甲醛渗透力很强、通过蛋白分子交联、硬化等而固定组织。本实验在处理完红细胞步骤后，在沉淀物中加入20 mL的95%乙醇进行预固定4 h，使蛋白变性、组织硬化等作用凝聚固定细胞，然后再进入全自动脱水机里进行1.5h的10%甲醛固定，使蛋白交联更进一步起固定作用。本研究采用95%乙醇与10%甲醛两者相结合的固定方式，使细胞在固定液浓度、性质上有梯度变化，两者结合更好的固定细胞。在固定时间上，研究表明2 h为细胞最佳固定效果[9]，本实验结果与前人研究有出入，本实验得出4 h后细胞成团紧凑，整个沉淀物可完整挑出且获得最多细胞量；用擦镜纸包好后放入包埋盒中，经全自动脱水机脱水、透明、浸蜡等步骤，再包埋、切片、全自动染色机HE染色完成细胞蜡块制作。镜下结果也显示细胞形态正常、背景干净、无红细胞、细胞结构清晰，很容易进行细胞学诊断。

综上所述，本实验对95%乙醇固定时间、红细胞处理、细胞固定液步骤选择上进行了摸索，实验结果也证实95%乙醇预固定4h后的切片完整不掉片、背景干净、细胞形态正常、结构清晰、获取细胞量多。本研究方法试剂需求少、步骤简单、花费低，因此可用于血性胸水细胞蜡块的制作，协助细胞学诊断精准化。

[1] 徐小艳，刘红伟，姜黄，等.联合检测细胞蜡块中的napsin A和甲状腺转录因子-1有助于肺腺癌胸水的诊断[J].南方医科大学学报，2015,35(11)：1610-1613.

[2] CHANG D Y,JIN W K，KWAN H K，etal．Detection and comparison of EGFR mutations in matched tumor tissues,cell blocks，pleural effusions，and sera from patients with NSCLC with malignant pleural effusion，by PNA clamping and direct sequencing[J]．Lung Cancer，2013,81:207-212.

[3] JIAN YZ,HONG TY,JING Z,etal.Cell block samples from malignant pleural effusion might be valid alternative samples for anaplastic lymphoma kinase detection in patients with advanced non-small-cell lung cancer[J].Histopathology ,2015,66:949-954.

[4] 郭秀云，刘军兰.明胶海绵在细胞蜡块技术中的应用[J].中国临床研究,2013，26(3)：202.

[5] 沈湘萍，陈艳.45 例胸腔积液细胞蜡块结合免疫组化在细胞学诊断中的应用[J].浙江实用医学，2014，19 (4)：264-266.

[6 马纪周，李娜，撖俊.蛋清液制作胸腹水细胞石蜡制片法[J].健康必读，2012，11(8)：118-119.

[7 陈建华，陈中，丁博.血浆凝固法胸腹水细胞块技术的临床应用[J].实验与检验医学,2012,30(4):412-413.

[8] 刘君，何洁华，罗荣珍，等.新柏超薄涂片技术的应用体会[J].诊断病理学杂志，2008，15(4)：343-344.

[9] 吴菡,孙苏安.乙醇固定时间在细胞蜡块技术中的应用[J].临床与实验病理学杂志，2015，31(1)：99-100.