人乳与牛乳中牛磺酸含量测定比较

李则均

（黑龙江完达山乳品有限公司质检中心，哈尔滨 150078）

人乳与牛乳中牛磺酸含量测定比较

李则均

（黑龙江完达山乳品有限公司质检中心，哈尔滨 150078）

本试验采用GB 5413．26-2010第二法丹磺酰氯柱前衍生法，应用紫外检测器测定人乳和牛乳四个不同时期的牛磺酸含量，并进行比较分析。结果发现，人乳中牛磺酸含量是牛乳的8．2倍，为以牛乳为原料的婴幼儿食品强化牛磺酸研究提供参考。检测波长254nm时，人乳中牛磺酸出峰时间为7．556min，牛乳中牛磺酸出峰时间为7．557min。本试验采用检出范围1．0～16．0μg/mL，在此范围内线性回归方程y=738．47x-26．162，R2＞0．9999。人乳中牛磺酸定性重复性RSD%(n=6)为0．068，定量重复性RSD%(n=6)为0．943。

人乳；牛乳；牛磺酸；丹磺酰氯柱前衍生

牛磺酸的化学式为C2H7NO3S，相对分子质量125.15，是一种可溶于水的白色或结晶性粉末。牛磺酸是机体含量最丰富的自由氨基酸，能够促进婴幼儿脑组织智力发育，提高视觉技能，改善内分泌增强免疫，有效防止缺铁性贫血，促进肠道双歧菌生成[1]。婴幼儿缺乏牛磺酸会导致智力发育迟缓，视网膜功能紊乱，免疫力低下等。研究表明，刚出生的婴幼儿缺乏合成牛磺酸的半胱氨酸磺酸基脱羧酶，极易造成牛磺酸缺乏[2,3]。婴幼儿的牛磺酸摄取主要来自母乳，而牛乳中牛磺酸含量很少，长期喂养未强化牛磺酸含量牛乳的婴幼儿，易造成牛磺酸缺乏。

目前关于人乳和牛乳中牛磺酸含量测定的方法一般采用氨基酸自动分析法、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法和超高效液相色谱-串联色谱法（HPLCMS/MS）[4]。氨基酸自动分析法仪器配置复杂，灵活性差，分析时间太长，易造成牛磺酸结构破坏影响检测结果。气相色谱法和HPLC-MS/MS法样品前处理复杂，气相色谱法衍生反应干扰多且反应复杂，尤其是HPLC-MS/MS法检测成本高，不利于广泛推广[5～7]。因此本试验采用高效液相色谱法测定，此方法前处理简单、灵敏度高，而且易改进分离条件。

本试验采用食品安全国家标准GB 5009.169-2016第二法（丹黄酰氯柱前衍生法），分别测定人乳和牛乳不同时期的牛磺酸含量，并对数据进行比较分析，为配方奶粉人乳化提供相关技术参考。样品前处理沉淀蛋白去除干扰，滤液柱前单磺酰氯衍生，紫外高效液相色谱测定，外标法定量[8]。

1 材料与方法

1．1 仪器与标准品

仪器：高效液相色谱（PE紫外检测器）；pH计（METTLER TOLEDO生产MP220）；数控超声波振荡器（KQ-1000DB,昆山市超声仪器有限公司）；涡旋混合器（IKA VORTEX生产，型号GENIUS 3）。

牛磺酸标准品（上海安普实验科技股份有限公司生产）；牛磺酸储备液：浓度1mg/mL；牛磺酸工作液，浓度分别为0μ g/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。

1．2 试剂

沉淀剂Ⅰ：150g/L亚铁氰化钾溶液，亚铁氰化钾（科密欧生产，分析纯）。沉淀剂Ⅱ：300g/L乙酸锌溶液，乙酸锌（科密欧生产，分析纯）。碳酸钠缓冲液：pH9.5,80mmol/L，无水碳酸钠（科密欧生产，优级纯）。丹磺酰氯溶液：1.5mg/mL，临用现配，丹磺酰氯（CNW生产，色谱纯）。盐酸甲胺溶液：20mg/ mL，盐酸甲胺（CNW生产，色谱纯）。乙酸钠缓冲液：10mmol/L，pH4.2，经0.45μm微孔膜过滤，无水乙酸钠（科密欧生产，优级纯）。

1．3 试验设计

1.3.1 人乳采集设计

研究表明牛磺酸含量在人乳中随着哺乳期时间变化而变化，根据人泌乳期分为：初乳期（产后0～9d内）、过渡期（产后9～30d）、成熟期（2～5个月）、晚乳期（6～12个月）。人乳采样分为四组，每组进行10个不同样本测定。

人乳的采集对象为产后0～12个月健康产妇。以“知情自愿”为原则，乳母饮食均衡，奶水充足，无重大急、慢性遗传传染病，无任何哺乳禁忌症。

1.3.2 牛乳采集设计

根据牛的泌乳期阶段划分：初乳期（产后0～14d）、泌乳早期（产后1～4个月）、泌乳中期（产后4～8个月）、泌乳后期（产后8个月～干奶）。牛乳采样分为四组，每组进行10个不同样本测定。牛乳来自完达山天然有机牧场。

1．4 样品前处理

样品提取：称取30g液体试样（精确至0.01g）于100mL容量瓶，加入50～60℃温水至70mL左右，超声振荡10min，冷却至室温。加入1mL沉淀剂，涡旋混合，定容过滤。

样液提取：吸取1mL滤液至10mL具塞玻璃试管，加1mL碳酸钠缓冲液、1mL丹磺酰氯溶液，涡旋混合，室温避光衍生2h，反应1h振荡一次，加100μL盐酸甲胺涡旋混合，终止反应。样液过0.45μm微孔膜上机待测。牛磺酸工作液与试样同等条件下衍生。

1．5 分离条件

色谱柱为美国Phenomenex生产的Luna C18，5μm，4.6×250mm。流动相为乙酸钠缓冲溶液：乙腈=70∶30。流速1mL/min。进样量20μL。紫外检测器检测波长254nm。

2 数据分析

2．1 牛磺酸目标峰的确定

采用同一前处理方法分别对牛磺酸标准品、含少量牛磺酸的牛乳、牛磺酸添加量为3mg/100g的牛乳、含有牛磺酸的人乳、牛磺酸添加量为10mg/100g的人乳进行测定，色谱图见图1～5。通过分析图1牛磺酸的目标峰保留时间初步确定为7.552min。分别对牛乳和人乳进行牛磺酸加标对比试验发现，牛乳（图2、图3）和人乳（图4、图5）中牛磺酸在该保留时间与其他峰都得到较好地分离，该保留时间内没有检测到干扰峰，并验证了此方法的有效性。因此可以确定图3牛乳中牛磺酸目标峰的保留时间为7.557min，图5人乳中牛磺酸目标峰的保留时间为7.556min。

图1 牛磺酸标准品图谱

图2 含少量牛磺酸牛乳图谱

图3 牛磺酸添加量为3mg/100g牛乳图谱

图4 含牛磺酸人乳图谱

图5 牛磺酸添加量为10mg/100g人乳图谱

2．2 标准曲线、检出限及人乳定量重复性

得出线性回归方程y=7 3 8.4 7x-2 6.1 6 2，R2＞0.9999，如表1和图6。

表1 牛磺酸标准溶液浓度与对应峰面积

图6 牛磺酸标准曲线

本试验采用GB 5413.26-2010第二法（丹黄酰氯柱前衍生法）检测，本文使用检出范围为2～32μg/mL，本文最低浓度2μg/mL低于方法检出限5μg/mL。

人乳牛磺酸检测叠加图见图7，样本为6时定性重复性RSD%为0.068，定量重复性RSD%为0.943。说明采用此方法测定人乳中牛磺酸，试验重现性良好。

图7 人乳牛磺酸定性定量色谱叠加图

2．3 人乳和牛乳中牛磺酸含量

表2 人乳和牛乳不同时期分组测定牛磺酸含量 单位：mg/100g

人乳和牛乳中不同时期试验分组测定牛磺酸含量见表2。通过表2人乳和牛乳不同时期的牛磺酸含量数据对比，得到图8。

图8 人乳和牛乳中不同时期牛磺酸含量对比折线图

人乳和牛乳中牛磺酸含量都是动态变化的，人乳中牛磺酸含量平均为9.31mg/100g，牛乳中牛磺酸含量平均为1.14mg/100g。人乳中牛磺酸含量是牛乳的8.2倍。人乳初乳期牛磺酸含量最高，分别是过渡期的1.4倍，成熟期的1.6倍，晚乳期的2.3倍。牛乳初乳期牛磺酸含量最高，分别是泌乳早期、泌乳中期的1.7倍，泌乳后期的2.1倍。

通过对50个实际人乳分组调查发现，乳母食用更多鱼类、蛋类、肝脏类制品能有效提高乳中牛磺酸含量，尤其在初乳期十分明显。

3 结论与展望

牛乳中牛磺酸含量少，人乳成分复杂，本试验通过采取增大称样量提高灵敏度，利用丹黄酰氯柱前衍生法，紫外检测器测定人乳和牛乳中牛磺酸含量。此方法不会破坏牛磺酸本身固有结构，试验数据准确。前处理操作简便，仪器基线稳定，重现性好，检测灵敏度高，可以满足分析要求，适用于大量样品检测工作。

通过对牛乳和人乳四个不同时期分组试验，发现牛乳中牛磺酸含量远远低于人乳。人乳中牛磺酸含量是牛乳中的8.2倍，且以初乳期牛磺酸含量最高。试验结果可为中国人乳中牛磺酸含量调查提供参考，为以后研制早产儿奶粉、细化喂养奶粉配方提供了理论依据。此检测方法为以后人乳和牛乳中其他低分子含量的多肽测定提供了参考。

[1] 李宏,郑娓,舒斯云．新生儿缺氧缺血性脑损伤的病理机制与牛磺酸的生物学功能[J]．解剖学研究,2015,4:290-293．

[2] 宋春梅．牛磺酸脑发育的研究进展[J]．第四军医大学吉林军医学院报,2002,1:76．

[3] 梁尚栋,李焕英．牛磺酸在神经系统中的生理和病理作用[J]．国外医学．生理病理科学与临床分册,2002,22(1):76．

[4] 王颖,张妮娜,段鹤君．食品中牛磺酸测定方法比较[J]．中国卫生检验杂志,2015,19:43-47．

[5] 郭建军．鲜人乳和鲜牛乳中主要游离氨基酸成分的分析比较[J]．福建轻纺,2000,6:7-9．

[6] 任向楠,荫士安．人乳中氨基酸的含量及分析方法研究发展[J]．氨基酸和生物资源,2013,35(3):63-67．

[7] 陶保华,陈启．超高效液相色谱-串联质谱同时测定人乳中的胆碱、L-肉碱、乙酰基-L-肉碱和牛磺酸[J]．食品安全质量检测学报,2014,07:157-163．

[8] 食品按国家标准．食品中牛磺酸的测定（GB 5009．169-2016）[S]．

Study on the Determination of Taurine in Human Milk and Bovine Milk

LI Ze-jun
(Quality Inspection Center, Heilongjiang Wandersun Dairy Products Co., Ltd., Harbin 150078)

The content of taurine in four different periods of human milk and milk was determined by UV detector before and after derivatization with GB 5413.26-2010. Through the experimental data, the content of taurine in human milk was 8.2 times that in milk, which could be used as reference for functional milk strengthening taurine. The peak time of taurine in human milk was 7.556min and the peak time of taurine in milk was 7.557min. The linear regression equation y=738.47x-26.162, R²＞ 0.9999 was used in the range of 1.0～16.0μg/mL. The RSD% (n = 6) of the taurine in human milk was 0.068 and the RSD% (n = 6) of the quantitative repeatability was 0.943.

Human milk; Milk; Taurine; Monosulfonyl chloride pre-column derivatization

TS252.1

A

1004-4264（2017）05-0032-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.009

2017-01-18

李则均（1983-），女，山东人，本科，工程师，研究方向为乳品质量分析。