抑制素基因疫苗及其在提高单胎家畜繁殖力方面的研究进展

于垚垚，刘深贺，王力军，王亚平，刘文浩，杨利国

（华中农业大学动物科技学院，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070）

抑制素基因疫苗及其在提高单胎家畜繁殖力方面的研究进展

于垚垚，刘深贺，王力军，王亚平，刘文浩，杨利国

（华中农业大学动物科技学院，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070）

本文就抑制素基因疫苗的发展历程、免疫效果的影响因素以及其在提高单胎动物繁殖力方面的应用研究进行文献综述,为促进抑制素基因疫苗的深入研究与推广应用提供参考依据。

抑制素；基因疫苗；繁殖力；单胎家畜

抑制素主要是由雌性动物的卵巢颗粒细胞以及雄性动物睾丸支持细胞所分泌的一种糖蛋白激素，其主要生理功能是抑制促卵泡素（FSH）的合成与分泌，从而降低循环血液中的FSH水平[1]。而抑制素基因免疫是将克隆有抑制素抗原基因的真核表达载体导入宿主体内，利用宿主细胞的转录翻译系统表达出抑制素抗原蛋白，从而激发宿主的免疫系统产生抗抑制素的抗体，中和外源和内源性的抑制素，释放对FSH合成和分泌的抑制作用，促进卵泡发育，增加排卵率，并最终达到提高动物繁殖力的效果。由于抑制素基因疫苗能够增加排卵率与双胎率，因而在提高单胎动物双胎率进而提高其繁殖力方面具有重大意义[2]，同时由于基因疫苗具有制备简单、便于储存和运输以及能够维持较长时间的免疫反应等优点，因而众多的研究者对抑制素基因免疫进行了深入的研究。

1 抑制素基因疫苗的研究进展

抑制素基因疫苗的研究始于1998年，由杨利国教授指导的两名博士研究生王进荣和姜勋平同时开展研究。王进荣[3]综合分析了抑制素α亚基的二级结构、两种抗原表位、亲水性曲线等，发现N端1-26或1-32、63-82、103-122可能包括抑制素α亚基的抗原表位。考虑到抗原值、亲水性及较多的Pro易形成coil结构，故取N端1-32或63-82为半抗原。姜勋平等[4]在此基础上将抑制素α亚基N端1-32肽基因克隆于真核表达载体pcDNA3.1，构建了抑制素基因疫苗pINH，免疫小鼠后抗体阳性率为30%，加强免疫后抗体阳性鼠的FSH水平显著升高。为了提高抑制素基因疫苗的免疫效果，茆达干等[5]将抑制素基因融合于乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的3端，并克隆于真核表达载体pcDNA3.1，构建了单拷贝的抑制素基因疫苗pcIS，用该疫苗免疫大鼠后，一次加强免疫后抗体阳性率可达到38.9%～50%，二次加强免疫后抗体阳性率可达到55.6%。随后，曹少先等[6]利用表位串联的原理将抑制素α亚基N端1-32肽基因插入质粒pcIS乙肝表面抗原第112～113氨基酸残基密码子之间构建了双拷贝的抑制素基因疫苗pcISI，免疫大鼠后，第6、8周抗体阳性率均达到了83.3%，且抗体阳性率在第2～6周均高于pcIS组，这表明双拷贝的抑制素基因疫苗具有更高的免疫原性。为了构建与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP）相融合的双抑制素基因疫苗，曹少先[7]又将双拷贝抑制素基因疫苗pcISI中的ISI片段融合于pEGFP—N1中EGFP基因的5’端，构建了双拷贝的抑制素基因疫苗pEGISI，这为研究抑制素基因疫苗的免疫机理提供了重要基础，同时由于该质粒以卡纳青霉素为选择压力，大大降低了由氨苄青霉素为选择压力而导致的过敏反应的风险。

随后吴结革等[8]又将具有免疫增强作用的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage Colony-stimulating factor, GM-CSF）分别插入双拷贝的抑制素基因疫苗pcISI和pEGISI,成功构建了GMCSF与抑制素融合表达质粒pCGMISI和pEGMISI，为研究GM-CSF基因在抑制素基因疫苗中的免疫增强作用奠定了基础。为了进一步提高抑制素基因疫苗的免疫效果，韩丽等[9]又将具有蛋白转导功能的牛孢疹病毒I型（Bovine Herpesvirus 1，BHV-1）VP22基因插入双拷贝的抑制素基因疫苗pEGISI，构建了真核表达载体pEGISI-VP22，并用该质粒免疫小鼠，结果表明VP22确实能够增强抑制素基因疫苗的免疫原性。

为了提高疫苗的安全性，便于在生产中推广应用，韩丽等[10]将平衡致死系统引入抑制素基因疫苗，将pCIS质粒中的IS序列分别插入到不含抗性基因的真核表达载体pVAX-asd与pYA3493中，构建了不含抗性基因的真核表达质粒pVAX-asd-IS与pYAIS，并转入asd 和crp双缺失的猪霍乱减毒沙门氏菌中，构建了重组菌C501（pVAX-asd-IS）和C501（pYAIS），这样不但提高了抑制素基因疫苗的安全性，还为抑制素基因疫苗提供了更多的免疫途径。

为了更有效地提高动物的繁殖力，本实验室淡新刚等又将与抑制素具有相似功能的RF酰胺肽（RF-amide related peptide，RFRP）引入抑制素基因疫苗。他们先将猪源INH α（1-32）连接到乙肝表面抗原S基因C末端，合成SINH；又将牛源RFRP-3 基因连接到乙肝表面抗原S基因C末端，合成SRFRP。最后将SINH和SRFRP基因片段分别插入到 pIRES 真核表达载体的两个多克隆位点，构建抑制素和促性腺激素抑制激素共表达质粒p-SINH/SRFRP。同时由于组织纤溶信号肽（tissue plasminogen activator，TPA）序列能够增强抗原的免疫原性，诱导产生很强的体液免疫反应，因而，淡新刚等又将TPA序列插入共表达质粒目的基因的N-端，构建了信号肽共表达质粒p-TPA-SINH/TPASFRFP[11]。

2 抑制素基因疫苗免疫效果的影响因素

2．1 给药方式

基因疫苗有多种给药方式，如注射（肌肉、皮下、静脉）、口服和鼻饲等[12]。但抑制素基因疫苗主要以肌肉注射方式居多，韩丽等分别采用口服和肌肉注射方式免疫小鼠，结果发现无论是肌肉注射还是口服均能诱导小鼠产生Th1和Th2型免疫反应，但肌肉注射的免疫效果更好，且能提高产仔数[10]。

2．2 免疫剂量

免疫剂量也是影响抑制素基因免疫的主要因素。用无抗性基因的抑制素真核表达质粒基因疫苗(重组菌C500(pXAIS))免疫奶牛，结果发现高剂量免疫组子宫孕角复旧时间短于对照组，且达到了显著水平[13]。而其用0.75、1.5、2.25、3.0mg的pcISI质粒免疫肉牛及南阳黄牛，结果均发现2.25mg的免疫剂量最佳[14,15]。而姜卫星等的研究结果也证明抑制素基因疫苗pCISI的最佳免疫剂量是2.25mg[16]。

2．3 免疫佐剂

有多种免疫佐剂可以增强抑制素基因疫苗的免疫效果。王水莲[17]比较了免疫佐剂脂质体与普鲁卡因的免疫增强效果，结果表明，普鲁卡因显著优于脂质体。随后郭宪等[18]利用串联抑制素重组质粒pcDNA-DPPISSDINH和pcDNA-DPPISSDINH-sC3d3分别免疫绵羊，结果表明，佐剂sC3d具有免疫增强作用，能够提高抑制素基因疫苗的免疫效果。茆达干等[19]经研究发现细菌DNA和gm-csf能够增强抑制素基因疫苗的免疫效果。

2．4 免疫次数和免疫间隔

免疫次数对抑制素基因疫苗免疫效果的影响也不尽相同，大部分的研究结果均表明加强免疫能够提高抑制素基因疫苗的免疫效果。但是韩丽以及梁爱心等的研究结果却表明，免疫次数的增加并没有提高基因疫苗的免疫效果，相反只免疫一次的效果更好[10,20]。免疫间隔也与抑制素基因疫苗的免疫效果息息相关，目前有关文献中的免疫间隔一般为14、21及28d等，但有关免疫间隔对免疫效果的影响还未见报道。

3 应用抑制素基因免疫技术提高单胎家畜繁殖力的研究进展

3．1 应用抑制素基因免疫技术提高羊繁殖力的研究进展

郭宪等用抑制素基因疫苗首次免疫绵羊以后，FSH水平高于对照组，而后在2次和3次免疫后FSH水平达到显著水平，且2次免疫后LH、E2、P等激素也高于对照组，3次免疫后，E2和P显著高于对照组，最终免疫绵羊后双羔率最高可达到30.0%，显著高于对照组[21]。而张德坤等的研究结果却表明，抑制素基因疫苗pCIS免疫能够影响母羊FSH的分泌水平，而对雌激素和孕激素则无显著影响[22]。同时，张德坤等用抑制素基因疫苗pCIS免疫母羊，双胎率可达到39.2%，显著高于对照组[23]。淡新刚等分别用质粒p-TPA-SINH/TPA-SRFRP、p-SINH/ SRFRP和p-SINH免疫绵羊，结果表明，三种疫苗均能诱发明显的免疫反应，且第3次免疫后20d，p-TPASINH/TPA-SRFRP免疫组的FSH和LH水平最高。三个试验组最终母羊的双羔率分别为37.5%、37.5%和12.5%[11]。

3．2 应用抑制素基因免疫技术提高牛繁殖力的研究进展

姜卫星等[16]用双拷贝的抑制素基因疫苗pCISI免疫南阳黄牛，结果发现抑制素抗体水平与黄体发育水平息息相关，抗体阳性牛两侧黄体明显比抗体阴性牛大。而王水莲等[24]的研究结果表明，抑制素基因免疫可以增加大卵泡、小卵泡、成熟卵泡数量以及卵泡总数量，同时也可以增加成熟卵泡与黄体直径，他们还发现抑制素抗体水平与成熟卵泡大小和黄体大小具有很强的相关性。崔先利等[25]的研究结果表明，抑制素基因疫苗pCISI能够促进双大卵泡发育、诱发排双卵并能诱发黄牛孪生。夏迪等[26]的研究还表明，非抗性筛选的抑制素基因疫苗还能促进奶牛产后子宫复旧，同时还可以提升奶牛的泌乳性能。

4 结束语

动物的繁殖力是指动物维持其正常生殖机能，繁育后代的能力。在畜牧生产中，繁殖力的高低直接影响畜牧场的经济效益，因而提高动物繁殖力具有十分重大的意义，特别是对于繁殖周期较长的单胎家畜如牛羊等。而抑制素基因疫苗的发展历程是免疫原性不断提升、安全性不断改善以及免疫程序不断完备的过程，随着科技的不断发展和众多研究者的不懈努力，我们有理由相信抑制素基因疫苗必将大规模应用于畜牧生产实践。

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Progress of Inhibin Gene Vaccine and Its Effects on Singletons Livestock Fertility

YU Yao-yao, LIU Shen-he, WANG Li-jun, WANG Ya-ping, LIU Wen-hao, YANG Li-guo
(Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Education Ministry of China, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

This paper elaborates on the development course of inhibin gene vaccine,the factors influencing its effects and its application on the improvement of singletons livestock fertility. And the objective of this paper is to provide basis for the better application of inhibin gene vaccine in livestock production practice.

Inhibin; Gene vaccine; Singletons livestock; Fertility

S823.3

A

1004-4264（2017）05-0016-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.005

第二届“牛人”摄影大赛作品 《秋意下的Hamra牧场》——熊倩 利拉伐

2016-12-08

于垚垚（1991-），山西晋城人，硕士研究生，主要从事动物生殖生理与生物技术的研究。

杨利国，教授。