槲皮素逆转结肠癌耐药细胞SW480/OXP耐药性研究

李彩丽，成 丹，孙泽群，刘 岳

湖北医药学院附属人民医院食管肿瘤研究所，湖北 十堰 442000

槲皮素逆转结肠癌耐药细胞SW480/OXP耐药性研究

李彩丽，成 丹，孙泽群，刘 岳

湖北医药学院附属人民医院食管肿瘤研究所，湖北 十堰 442000

目的 观察槲皮素(Quercetin,Que)对结肠癌耐药细胞SW480/OXP耐药性的逆转，并探讨其可能的机制。方法 体外诱导结肠癌耐药细胞SW480/OXP，用10 μg/ml、20 μg/ml的Que处理SW480/OXP细胞，CCK8法检测对其耐药性的影响，罗丹明123检测细胞膜泵功能，实时荧光定量PCR检测MDR1及E-cadherin mRNA的表达，Western blotting检测P-gp和E-cadherin蛋白的表达。结果 10 μg/ml Que及20 μg/ml Que对SW480/OXP的逆转倍数分别为2.25和3.08。经Que处理的SW480/OXP细胞中罗丹明123残余荧光强度大于SW480/OXP细胞。以10μg/ml和20μg/ml Que处理后，MDR1/P-gp mRNA及蛋白的相对表达量均下降，E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量则上升。结论 Que可逆转SW480/OXP的耐药，可影响P-gp的功能，降低MDR1/P-gp mRNA及蛋白的表达，并可诱导耐药细胞E-cadherin mRNA和蛋白表达上升。

槲皮素；耐药；奥沙利铂

目前大肠癌是主要的致死性肿瘤之一，化疗仍是临床治疗大肠癌的重要手段，预防和逆转大肠癌耐药性的产生，是提高大肠癌治疗效果的重要手段，我们诱导了奥沙利铂(Oxaliplatin, OXP)耐药的大肠癌细胞系SW480/OXP，观察槲皮素(Quercetin, Que)对SW480/OXP细胞耐药的逆转情况，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 OXP购自江苏恒瑞药业，CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所，Que和罗丹明123购自美国Sigma公司，抗P-gp抗体购自德国Merck公司，抗E-cadherin抗体购自美国Bioworld Technology公司。Trizol购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自瑞士Rhoche公司。荧光Mix购自北京天根生化科技有限公司，所需引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 结肠癌耐OXP细胞的诱导 人结直肠癌SW480细胞系保存于本研究所细胞中心。细胞在含100 g/L新生牛血清的RPMI 1640培养液中贴壁生长，置于37 ℃、体积分数5% CO2饱和湿度培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。按照公式计算OXP峰值血浆浓度(peak plasma concentration, PPC)为4.5 μg/ml [PPC (μg/ml) =50×D×2×103/500，其中D 指的是临床应用剂量(mg·kg-1·d-1)][1]。采取低浓度长时间诱导的方式诱导SW480对OXP耐药。SW480细胞贴壁后，换用含0.1×PPC浓度的OXP完全培养基，使OXP与SW480细胞持续接触24 h后，弃培养液，换用不含OXP的完全培养基，逐渐去除死亡细胞，待其恢复生长后，再次换用含0.1×PPC浓度的OXP培养液，24 h后撤药换用完全培养基，待其恢复生长后换用含有0.125×PPC的OXP培养基，并重复1次。如此反复换液、传代，以1.25～1.5倍的梯度逐步提高OXP浓度，直至其能耐受1×PPC浓度的OXP，将其维持培养在含1 μg/ml OXP的培养基中，命名为SW480/OXP。

1.3 SW480/OXP的耐药性检测 取对数生长期的SW480细胞及SW480/OXP细胞，常规消化，制成1×105个/ml浓度的细胞悬液，在96孔板中接种90 μl的细胞悬液，培养过夜，向孔中加入OXP，使培养液中OXP的浓度为分别为0.5 μg/ml、5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml，每种浓度设3个复孔，同时设立无细胞仅有培养液的调零组和未加药物的空白组，培养24 h，弃去孔中培养液，加入含10% CCK-8溶液的培养液100 μl，37 ℃孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。细胞抑制率(%)= (OD空白孔-OD待测孔)/(OD空白孔-OD调零孔)×100%。实验重复3次，SPSS软件计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory oncentration，IC50)，耐药指数(resistance index, RI)=IC50(耐药细胞)/IC50(亲本细胞)。

1.4 Que对SW480/OXP细胞的耐药逆转作用10 μg/ml、20 μg/ml 的Que预处理SW480/OXP细胞24 h，对照组加入溶媒(1‰ DMSO)常规消化，制成1×105个/ml细胞悬液，在96孔板中接种90 μl的细胞悬液，培养过夜，向孔中加入OXP，按照1.2的方法计算IC50及RI，Que对SW480/OXP的逆转倍数为使用Que前 IC50/使用Que后 IC50)。

1.5 罗丹明123排出实验 制备SW480/OXP单细胞悬液，以1×106个/ml的浓度接种24孔板，分别加入10 μg/ml、20 μg/ml的Que处理24 h，对照孔加入溶媒，换用含200 ng/ml罗丹明123的新鲜培养液，37 ℃培养箱中培养孵育30 min，洗涤3次，换用正常培养液继续孵育60 min，荧光显微镜下观察。

1.6 实时荧光定量PCR 10 μg/ml、20 μg/ml Que干预SW480/OXP细胞24 h，等量的溶媒处理对照组24 h，Trizol试剂盒提取总RNA，按照Rhoche逆转录和天根荧光Mix说明书逆转录和PCR扩增反应。以β-actin作为内参照。以2-ΔΔCt法处理数据，进行相对定量分析，所用PCR反应所用引物序列如下：MDR1上游序列5′-ATATCAGCAGCCCACATCAT-3′，下游序列5′-GAAGCACTGGGATGTCCGGT-3′；E-cadherin上游序列5′-TGATTCTGCTGCTCTTGCTGTT-3′，下游序列5′-CAAAGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3′；β-actin上游序列5′- CAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3′，下游序列5′-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3′。

1.7 Western blotting检测P-gp和E-cadherin水平 10 μg/ml、20 μg/ml Que干预SW480/OXP细胞24 h，溶媒处理对照组24 h，收集对数生长期的3种细胞，冰PBS洗2次, 加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃离心，取上清; 蛋白上样量20 μg，10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电流12～15 mA，湿转120 min，电压70 V；1% BSA室温封闭1 h；加小鼠抗P-gp(1∶100)和兔抗E-cadherin(1∶1 000)，4 ℃过夜，分别以羊抗小鼠和羊抗兔二抗(1∶5 000)反应2 h，ECL显色，BIO-RAD凝胶成像系统扫描、分析。

2 结果

2.1 Que对SW480/OXP 耐药性的逆转 如图1所示，低浓度(0.5 μg/ml)OXP联合Que后对SW480/OXP细胞的抑制率并无明显影响(P>0.05)，5 μg/ml以上的OXP联合Que后对SW480/OXP细胞的抑制率大于单用OXP(P<0.05)，SW480细胞、SW480/OXP、SW480/OXP联合10 μg/ml Que及20 μg/ml Que的OXP IC50分别为9.92±1.23、107.65±3.24、47.81±0.83、34.90±4.26，SW480/OXP、SW480/OXP联合10 μg/ml Que及20 μg/ml Que对OXP的耐药指数分别10.85、4.82和3.52。10 μg/ml Que及20 μg/ml Que对SW480/OXP的逆转倍数分别为2.25和3.08。

图1 Que对SW480/OXP细胞OXP耐药性的影响Fig 1 Effect of the Que on drug resistance for SW480/OXP cells

2.2 罗丹明123荧光排出实验 如图2所示，罗丹明123可进入SW480/OXP细胞，积聚在核膜和胞浆周围，发出明亮的绿色荧光，洗去罗丹明123并换液孵育60 min后，SW480/OXP荧光明显减弱，Que处理的和SW480/OXP细胞中残存的荧光强度要大于SW480/OXP细胞。

2.3 MDR1和E-cadherin mRNA的水平 如图3所示，SW480/OXP细胞为对照组，经10 μg/ml和20 μg/ml Que处理后，MDR1 mRNA相对表达量分别为0.55±0.05和0.35±0.05，E-cadherin mRNA相对表达量分别为1.39±0.11和2.61±0.32，经Que处理后，MDR1、E-cadherin mRNA表达与SW480/OXP组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 Que对SW480/OXP细胞罗丹明123排出的影响(100×) 罗丹明123可聚集在SW480/OXP细胞中(a，b，c)，发出黄绿色荧光，60 min后SW480/OXP细胞可排出大部分罗丹明123，细胞内荧光强度明显减弱(d)，而用Que处理过的SW480/OXP细胞(e，f)中荧光排出延缓。荧光强度强于正常SW480/OXP细胞

Fig 2 Effect of the outflow of Rhodamine 123 for SW480/OXP cells(100×)

2.4 P-gp和E-cadherin 的蛋白表达 如图4所示，以SW480/OXP细胞为对照组，经10 μg/ml 和20 μg/ml Que处理后，P-gp蛋白相对表达量分别为0.79±0.03和0.82±0.12，E-cadherin 相对蛋白表达量分别为1.22±0.10和1.56±0.12，给予Que处理后，P-gp、E-cadherin蛋白表达与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

注：与SW480/OXP组比较，*P<0.05，与SW480/OXP+10 μg/ml Que组比较，**P<0.05 。

图3 MDR1和E-cadherin mRNA的相对表达量
Fig 3 Relative expression of MDR1 and E-cadherin mRNA

注：与SW480/OXP组比较，* P<0.05；与SW480/OXP+10 μg/ml Que组比较，** P<0.05 。

3 讨论

我国结肠癌患病率、病死率逐年上升，2011年病死率已达到7.7/10万人[2]，尽管治疗手段在不断更新，但结肠癌的耐药，依旧是结肠癌治疗面临的严峻问题之一。天然的药物成分对肿瘤耐药的逆转作用引起了广泛的关注，Que是一种天然的黄酮类化合物, 可从多种植物中提取，具有很强抗氧化自由基活性而具有抗炎症、抗衰老及抗肿瘤生物学特性，可逆转卵巢癌等肿瘤细胞的耐药[3]。我们以具有一定的天然耐药性SW480细胞为亲本细胞[1，4]，进一步诱导其获得性耐药，观察Que对SW480/OXP耐药的逆转效果，及对P-gp和E-cadherin表达的影响。研究发现，Que可逆转SW480/OXP对OXP的耐药，且这种逆转作用有一定浓度依赖性，10 μg/ml及20 μg/ml Que对SW480/OXP的逆转倍数分别为2.25和3.08。

P-gp由MDR1编码，是能量依赖性的细胞膜外排泵，也是重要的耐药基因。在结直肠癌中，P-gp的过量表达，可引起化疗药物的外排，从而影响患者的化疗效果[5]，罗丹明123是P-gp的作用底物，可通过罗丹明123荧光的表达，评价P-gp的泵功能。E-cadherin是一类主要介导同质细胞间黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，是肿瘤进展的关键蛋白，是上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的重要标志物[6]。E-cadherin表达降低及其与许多肿瘤的恶性过程密切相关，如侵袭、转移、耐药等。P-gp与EMT在某种程度上有一定的关联性，且受某些共同的通路调节[7-8]。

我们在前期研究中[9]，已经发现了SW480/OXP在诱导产生耐药性的过程中，出现P-gp升高及E-cadherin下降的情况。已有研究证实，EMT现象与肿瘤耐药相关[10]，而在使用Que处理SW480/OXP时也发现罗丹明123荧光排出延缓，并伴有P-gp和MDR1 mRNA和蛋白的表达下调及E-cadherin的表达上调。这提示Que可能通过抑制耐药肿瘤细胞P-gp的功能和表达，减少药物的外排作用，E-cadherin的升高提示，Que可能逆转SW480在耐药过程中产生EMT，降低肿瘤细胞的“干细胞性”，从而逆转耐药肿瘤细胞的耐药。

综上所述，Que 可以逆转SW480/OXP的耐药，影响P-gp的功能，降低MDR1/P-gp基因和蛋白的表达，并引起耐药细胞有E-cadherin基因和蛋白表达上升。但是，因为Que溶解性等其他原因，我们没有进行更高浓度Que逆转效果的观察，进一步深入研究Que在耐药逆转中所起的作用将有较大的临床应用价值。

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(责任编辑：马 军)

Study of drug resistance by the Quercetin in human colorectal cancer SW480/OXP cells

LI Caili, CHENG Dan, SUN Zequn, LIU Yue

Institute of Esophageal Tumor, Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China

Objective To observe the effects of Quercetin (Que) on SW480/OXP colorectal cancer cells and to investigate the possible mechanism of action.Methods The oxaliplatin (OXP) resistant colorectal cancer cell line SW480/OXP were induced， SW480/OXP were treated with 10 μg/ml and 20 μg/ml by Que，the chemosensitivities and resistance indexes were tested by CCK8 assay, the function of P-gp was determined by Rhodamine 123, the expressions of MDR1/P-gp and E-cadherin were determined by real-time PCR and Western blotting.Results The reversal indexes of 10 μg/ml and 20 μg/ml Que on SW480/OXP were 2.25 and 3.08, respectively. After treated with 10 μg/ml and 20 μg/ml Que, the fluorescence outflow of Rhodamine 123 were delayed, and the expressions of MDR1/P-gp mRNA and protein were decreased, but the expressions of E-cadherin mRNA and protein were upregulated.Conclusion The drug resistance of SW480/OXP can be reversed by Que and influence the expressions of MDR1/P-gp and E-cadherin.

Quercetin; Drug resistance; Oxaliplatin

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.05.019

湖北省教育厅科研计划支持(B20122425)

李彩丽，硕士，研究方向：消化道疾病基础。E-mail:licailili@163.com

刘岳，博士，副教授，研究方向：肿瘤临床。E-mail:liuyue_119@163.com

R735.3+5

A

1006-5709(2017)05-0551-04

2016-01-08