广西毛葡萄及酿酒皮渣中齐墩果酸的分析研究

张 劲，黄小云，秦晓媛，谢太理，管敬喜，文仁德，谢林君，成 果

（1.广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁530007；

2.广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁530021）

广西毛葡萄及酿酒皮渣中齐墩果酸的分析研究

张 劲1，黄小云1，秦晓媛2，谢太理1，管敬喜1，文仁德1，谢林君1，成 果1

（1.广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁530007；

2.广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁530021）

探索生理活性成分齐墩果酸在毛葡萄中的分布，考察利用毛葡萄酿酒皮渣提取齐墩果酸的可行性。以广西毛葡萄及酿酒皮渣为实验原料，采用高效液相色谱法（HPLC）分析毛葡萄果皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及酿酒皮渣和酿酒葡萄籽中齐墩果酸的含量。结果表明，在毛葡萄果皮及酿酒皮渣中均检出齐墩果酸，但在葡萄汁、葡萄酒及葡萄籽中未检出。齐墩果酸天然存在于毛葡萄果皮中，由于其水不溶性，通过浸渍发酵无法溶入葡萄酒中。利用毛葡萄酿酒皮渣提取齐墩果酸为葡萄酒酿酒废弃物综合利用提供了新思路。

毛葡萄； 酿酒皮渣； 齐墩果酸

齐墩果酸（oleanolic acid,OA），又名庆四素，是一类五环三萜化合物，以游离态和糖苷键合形式广泛存在于女贞子、连翘、景天三七、人参、雪胆、夏枯草等药用植物中[1]，并且存在于木瓜[2]、葡萄[3]、大枣等食物中。据研究报道，OA具有护肝、解肝毒、降转氨酶、降血糖、降血脂、抗炎抗病毒、抗突变、抗癌等多重药理作用[1]。

近年来，对于葡萄中齐墩果酸的发现、含量测定以及分离提取的研究越来越多。研究发现，OA主要存在于葡萄皮中[4]，含量较高的葡萄品种多集中于新疆产地鲜食及酿酒葡萄品种，如索索葡萄[5]、和田红、木讷格、无核白、马奶子克里米札特、巨峰等[6]，另外，刺葡萄籽多酚提取物中也发现OA的存在[7]。目前，葡萄中齐墩果酸的研究领域多集中于含量测定[6]、提取工艺[8-9]及药理作用[10-11]等方面。

毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)是葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis L)真葡萄亚属(E-uvitis)东亚种群的一个种，原产于中国，是我国葡萄属东亚种群中分布最广的一个野生种[12]。毛葡萄是广西分布最广的葡萄属野生品种，含有丰富的维生素、氨基酸、不饱和脂肪酸、矿物质、双糖苷花色苷、超氧化物歧化酶、白藜芦醇等营养功效成分，食用或饮用葡萄酒具有抗衰老、软化血管、抗癌等多重保健作用[13]。本研究首次探索生理活性物质齐墩果酸在广西毛葡萄中的分布情况，探索利用毛葡萄酿酒皮渣提取齐墩果酸的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

毛葡萄：2016年8月采自广西罗城，品种为“野酿2号”，由广西农科院生物所鉴定。

毛葡萄酒及酿酒皮渣：由广西农科院葡萄与葡萄酒研究所酿造工艺研究室利用野酿2号毛葡萄按照干红酿造工艺发酵酿造干红葡萄酒，在酒精发酵结束时分离酿酒皮渣（含葡萄籽）。

样品前处理：取1 kg毛葡萄果实，人工去皮，分离葡萄籽，准确称重，计算皮果比和籽果比；果肉经匀浆、离心（8000 r/min，10 min），取上清液果汁备用；葡萄皮和葡萄籽自然晾干，加液氮粉碎，经冷冻干燥（-58℃，24 h），计算得率，葡萄皮及葡萄籽干粉备用。

酿酒皮渣：称取1 kg酿酒皮渣，分离皮渣与葡萄籽，60℃热风干燥，粉碎，过100目筛，计算皮渣和葡萄籽得率，干粉备用。

试剂：齐墩果酸（HPLC），Sigma；甲醇（色谱级），Fisher；水为实验室超纯水。

仪器设备：高效液相色谱仪（LC-20AT），日本岛津；高速离心机（TG16-WS），湖南湘仪；真空冷冻干燥机（Alpha 1-2 LDplus），德国Christ；超声波清洗机（XUB25），Grant；电热鼓风干燥箱，上海跃进。

1.2 实验方法

1.2.1 OA的提取

葡萄皮、葡萄籽样品：取经干燥的葡萄鲜果分离的葡萄皮、葡萄籽及酿酒后的葡萄皮渣和葡萄籽干粉，准确称量1.0000 g，用甲醇定容至25 mL，超声波提取30 min，常温浸渍30 min，经高速离心（8000 r/min，10 min），取上清液1 mL，用甲醇定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液上机进行HPLC分析。

葡萄汁样品：取澄清葡萄汁样品，稀释10倍，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液上机进行HPLC分析。

葡萄酒样品：取葡萄酒样品，稀释50倍，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液上机进行HPLC分析。

1.2.2 OA的HPLC分析

色谱条件：岛津InertSustainC18（250mm×4.6mm× 5 μm），流动相：甲醇∶水=85∶15（v/v），检测器：UV检测器，波长210 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

标准曲线绘制：准确称取10 mg OA标准品，用甲醇定容至10 mL，配制成1 mg/mL的标准试剂母液，取母液配制成10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的标准品溶液，按照色谱条件进样分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理

针对1.1中葡萄皮、葡萄籽、酿酒葡萄皮渣、酿酒葡萄籽样品前处理各步骤的样品得率进行计算，结果见表1。葡萄鲜果中葡萄皮、葡萄籽含量和酿酒皮渣中皮、籽含量用于评价酿酒皮渣综合利用的可行性，样品干燥得率用于最终计算鲜样中齐墩果酸的含量。

2.2 OA线性关系考察

根据HPLC的分析结果，标准品在19.617 min出峰，色谱图见图1。以标准品浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，见图2。标准曲线为：Y=5439.5X-1238，R2=0.9999，线性关系良好。

图1 OA标准品HPLC色谱图

表1 样品前处理中葡萄皮、葡萄籽得率

图2 OA标准曲线

2.3 OA测定结果

根据样品的HPLC分析结果，样品中OA出峰时间在19.6 min左右，根据样品中OA的峰面积和标准曲线，计算各样品中的OA含量，结果见表2。

结果表明，毛葡萄含有齐墩果酸，主要集中于葡萄皮中。葡萄中营养成分多存在于果肉中，如有机酸、氨基酸等，而生物活性成分多分布在果皮与籽中，如白藜芦醇、黄酮、原花青素等。有研究[3，14]发现，齐墩果酸存在于葡萄皮中，与本研究的结论一致，但文献中少有报道葡萄籽、葡萄汁及葡萄酒中的OA测定研究进展，本研究表明，毛葡萄中齐墩果酸存在且仅存在于葡萄皮中。报道[3-4]认为，国内OA含量较高的葡萄主要为新疆产地的品种，如索索葡萄、和田红、木讷格、马奶子等，而欧洲葡萄品种中含量很低。本研究结果表明，广西毛葡萄富含齐墩果酸，且含量高于新疆产地葡萄。

表2 毛葡萄中齐墩果酸含量

从含量上分析，干样品的酿酒葡萄皮渣中OA含量高于鲜葡萄皮中，由2.1中样品前处理得率数据，酿酒葡萄皮渣得率为鲜葡萄皮的1/2左右，说明湿样品中，鲜葡萄皮中OA含量仍高于酿酒葡萄皮渣中，这是因为酿酒葡萄皮渣中不仅含有葡萄皮，而且含有一定量的葡萄果肉（酒泥）。马龙等[3，6]的研究认为，新疆产葡萄皮中OA含量在1%左右，且酿酒后的皮渣中OA含量高于新鲜葡萄皮，其同样是用干样品含量计。毛葡萄干红葡萄酒酿造中，一般产生30%酿酒皮渣（含籽），根据2.1中得率计算，1 t毛葡萄酿造干红葡萄酒产生的皮渣中在理论上含有778.7 g齐墩果酸，具备工业化提取利用价值。

从毛葡萄、葡萄酒及酿酒葡萄皮渣中OA存在分布分析，新鲜葡萄皮、酿酒葡萄皮渣中含有OA，而葡萄籽、葡萄汁及葡萄酒中均未检出OA。结果表明，葡萄果实中的OA仅存在于葡萄皮中，且通过发酵浸渍OA无法富集进入葡萄酒中。OA为齐墩果酸烷型五环三萜化合物，不溶于水，可溶于乙醇、氯仿、丙酮[15]。葡萄酒的酒精度为12%vol左右，OA无法溶解。OA具有护肝、解肝毒等丰富的生理作用，然而仅存在于葡萄皮中，通过葡萄鲜食或饮用葡萄酒均无法摄入OA。利用发酵后的酿酒葡萄皮渣提取OA，为酿酒废弃物的综合利用提供了一条新的思路。

2.4 精密度实验

分别精确称取野酿2号葡萄皮粉末和酿酒葡萄皮渣样品粉末1.0000 g，按照样品提取和测定方法条件进行实验，各平行6次。结果葡萄皮中齐墩果酸的平均含量为1.639 g/100 g，RSD为2.477%；酿酒葡萄皮渣中OA的平均含量为1.697 g/100 g，RSD为4.310%。表明该实验提取和测定方法精密度良好。

2.5 稳定性实验

精确称取野酿2号葡萄皮粉末1.0000 g，按照样品提取和测定方法进行实验，在0～12 h，每1 h进样分析一次，记录峰面积，计算测定结果。结果表明12 h内OA峰面积无明显变化，13次样品测试，OA平均含量为1.629 g/100 g，RSD为0.334%，说明样品提取的OA测定稳定性良好。

2.6 回收率实验

精确称取野酿2号葡萄皮粉末1.0000 g共9份，分为3组平行，每组分别加入10 mg/mL的OA标准品试剂母液1 mL、2 mL、3 mL，每组平行3份，按照样品提取和测定方法实验，9次实验结果表明，OA平均回收率为103.06%，RSD为1.41%。表明本实验方法回收率高，可以满足分析要求。

3 结论

本研究用HPLC法测定了广西毛葡萄中葡萄皮、葡萄籽、葡萄汁、葡萄酒及酿酒葡萄皮、酿酒葡萄籽等样品中的齐墩果酸含量。葡萄果实仅葡萄皮中存在齐墩果酸，葡萄汁和葡萄籽中均不含有齐墩果酸，且通过发酵浸渍，齐墩果酸无法溶入葡萄酒中。酿酒后的葡萄皮渣中富含齐墩果酸，具备提取利用的价值。本研究团队今后将就毛葡萄皮渣齐墩果酸综合利用和齐墩果酸功能型葡萄酒为研发方向继续深入研究。

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[4] 杨勇,杨俊祥,宫霞,等.葡萄及葡萄属植物中的天然活性物质研究与利用现状[J].酿酒科技,2011(6)：75-79.

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Analysis of Oleanolic Acid in Vitis quinquangularis Rehd and Its Skin Residues after Wine Making

ZHANG Jin1,HUANG Xiaoyun1,QIN Xiaoyuan2,XIE Taili1,GUAN Jingxi1, WEN Rende1,XIE Linjun1and CHENG Guo1
(1.Viticulture and Wine Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007;
2.Guangxi&ASEAN Inspection&Testing Center For Food and Drug Safety,Nanning,Guangxi 530021,China)

The distribution of biologically-active component oleanolic acid in Guangxi V.quinquangularis Rehd was explored and the feasibility of extracting oleanolic acid from V.quinquangularis Rehd skin residues after wine making was discussed.V.quinquangularis Rehd and its skin residues were used as the experimental raw materials,and oleanolic acid content in V.quinquangularis Rehd skin,seed,juice,wine and skin residues was measured by HPLC.The results showed that,oleanolic acid was detected in fresh fruit skin and skin residues,but not in seed,juice and wine.As a conclusion,oleanolic acid naturally exists in V.quinquangularis Rehd skin and it could not dissolve in wine due to its water-insoluble property.The extraction of oleanolic acid from skin residues was feasible and it was a new pathway for comprehensive utilization of grape pomace.

Vitis quinquangularis Rehd;skin residues;oleanolic acid

TS261.2；TS261.9；TS261.7

A

1001-9286（2017）05-0099-04

10.13746/j.njkj.2017010

广西农业科学院基本科研业务专项（桂农科2015YM05、桂农科2015YT85和桂农科2015JZ150），广西自然科学基金（2015GXNSFBA139091）。

2017-01-16

张劲（1986-），男，助理研究员，硕士，研究方向为农产品加工及贮藏，E-mail：86562900@qq.com。

成果（1987-），女，助理研究员，博士，研究方向为酿酒葡萄生理代谢，E-mail：berry713@163.com。

优先数字出版时间：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1001.002.html。