超高效液相色谱法测定新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1不确定度评定

郭金喜，远 辉

(1.新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院，新疆乌鲁木齐830011；2.国家农副产品质量监督检验中心，新疆乌鲁木齐830011)

超高效液相色谱法测定新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1不确定度评定

郭金喜1，2，远 辉1，2

(1.新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院，新疆乌鲁木齐830011；2.国家农副产品质量监督检验中心，新疆乌鲁木齐830011)

对超高效液相色谱法测定新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1的含量进行不确定度评定，为建立有效的质量控制方法提供参考。依据CNAS—GL06《化学分析中不确定度的评估指南》和JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，建立了数学模型，分析了超高效液相色谱法测定新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1不确定度来源，并对数学模型中各不确定度分量的来源进行分析、量化和合成，得出黄曲霉毒素B1的扩展不确定度。结果表明，影响测量结果不确定度的主要因素为样品称量、溶液体积、最小二乘法标准曲线拟合、样品回收率等。本实验的不确定度为1.06 μg/kg。

超高效液相色谱； 巴旦木； 黄曲霉毒素B1； 不确定度

黄曲霉毒素是黄曲霉菌的次级代谢产物，其中对人体最具威胁的是具致癌性的黄曲霉毒素B1，主要作用于肝脏，产生致癌、致畸、致突变等严重危害[1]。目前，世界各国和地区对食品中黄曲霉毒素均有明确的限量要求[2-3]。我国食品安全标准中规定，巴旦木中黄曲霉毒素B1的限量为5.0 μg/kg。巴旦木是食用价值很高的新疆特产，富含脂肪、蛋白质、淀粉、糖，以及少量维生素和人体不可缺少的18种微量元素，是新疆特有的坚果及坚果制品的重要原料[4-6]。本研究依据CNAS—GL06《化学分析中不确定度的评估指南》和JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》规定的方法[7-8]，建立了数学模型，分析了超高效液相色谱法测定新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1不确定度来源，并对各个不确定分量进行了量化处理，得出新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1的扩展不确定度，为测定新疆黄曲霉毒素B1的质量控制提供一定的依据[9-11]。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

样品：某企业提供新疆巴旦木。

仪器与试剂：2695高效液相色谱仪Waters公司；黄曲霉毒素免疫亲和柱（北京中检维康公司）；黄曲霉毒素B1标准品(Sigma公司），1.055 μg/mL，误差范围±0.002 μg/mL；甲醇(色谱纯)，美国J.T. Baker；其他试剂均为分析纯。

1.2 检测方法

按照GB/T 18979—2003《食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》中HPLC法，准确称取试样25.00 g，加入5 g氯化钠及（7+3）甲醇水125 mL，以均质器高速搅拌提取2 min。将免疫亲和柱放于固相萃取仪上，准确移取15 mL滤液注入免疫亲和柱中，调节压力以6 mL/min的流速过免疫亲和柱，直至2～3 mL空气通过柱体。准确加入1 mL色谱甲醇洗脱，流速为1～2 mL/min，收集全部流出液于样品瓶中，供测试使用。经反相色谱柱分离后，测定黄曲霉毒素B1含量，根据保留时间和峰面积进行定性和定量[12-13]。

1.3 数学模型建立

1.3.1 数学模型

不确定度的计算，首先要明确被测值计算的数学模型，从而分析其可能的不确定来源。只有当影响被测值不确定度的基本因素都被考虑在内，所得到的各自的相对不确定度值才可以在整个计算中被采纳[14-15]。本实验中黄曲霉毒素B1含量计算数学模型为：

式中：X——试样中黄曲霉毒素B1的含量，μg/kg；

m——试样质量，g；

V1——样品提取液总体积，125 mL；

V2——免疫亲和柱上样体积，15 mL；

V3——样品定容体积，1 mL；

c——进样体积中黄曲霉毒素B1的浓度，ng/mL；

f——回收率。

1.3.2 不确定度分量的主要来源及其分析

该方法前处理过程主要为手工操作，受人为因素影响较大。根据检测方法和实际操作情况，高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1不确定度主要有以下几个来源：一是样品称量引入的不确定度；二是样品前处理、定容时溶液体积带来的影响；三是最小二乘法标准曲线拟合产生质量浓度（c）的不确定度；四是回收率带来的不确定度[16]。

2 不确定度分量

2.1 样品称量质量m的不确定度

标准要求称样质量为25.00 g，JJG 539—1997《数字指示秤》规定，该准确级的天平最大允许误差为±0.005 g，按矩形分布原则，称样时由天平的最大允许误差导致的样品质量不确定度为：

2.2 溶液体积的不确定度

该不确定度由3个部分构成：一是样品提取液体积（V1）所带来的不确定度；二是由免疫亲和柱上样体积(V2)引入的不确定度；三是样品定容体积（V3）产生的不确定度[17-18]。

2.2.1 样品提取液体积V1的不确定度

样品提取液使用250 mL量筒量取（7+3）甲醇水125 mL，JJG 196—2006《常用玻璃量器》规定：20℃时250 mL量筒的容量允许误差为±1 mL，按矩形分布，则量筒量取提取液体积引入的不确定度分量为：

2.2.2 免疫亲和柱上样体积(V2)的不确定度

使用15 mL单标移液管准确吸取15 mL提取液进行免疫亲和柱法，JJG 196—2006《常用玻璃量器》规定：20℃时15 mL单标移液管（A级）的容量允许误差为±0.025 mL，按矩形分布，则免疫亲和柱上样体积引入的不确定度分量为：

2.2.3 样品定容体积（V3）的不确定度

样品最终定容使用1 mL单标线移液管移取色谱级甲醇进行定容，JJG196—2006《常用玻璃量器》规定：20℃时1 mL单标线移液管（B级）的容量允许误差为±0.015 mL，按矩形分布，则单标线吸量管定容引入的不确定度分量为：

2.3 最小二乘法标准曲线拟合带来的黄曲霉毒素B1质量浓度（c）的不确定度

配制出质量浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL共5个校准标准溶液，在高效液相色谱仪上测得的峰面积见表1。测得巴旦木中黄曲霉毒素B1的峰面积，然后由校准曲线计算黄曲霉毒素B1的质量浓度c，在采用最小二乘法拟合校准曲线时，计算得到的前处理液中黄曲霉毒素B1的质量浓度c的不确定度仅与峰面积的测量不确定度有关[19-20]。

对5个校准标准溶液各测量3次，共计15次。测量得到的色谱峰面积A见表1。

表1 校准标准溶液的峰面积测定结果

拟合校准曲线的方程为：

式中：Ai——色谱峰面积；

ρi——校准标准溶液黄曲霉毒素B1的质量浓度；

B0——拟合校准曲线的截距；

B1——拟合校准曲线的斜率。

由下式可得B0和B1分别为：

由下式可得色谱峰面积测量的实验标准差为：

对待测样品巴旦木共测量6次，即p=10。测得样品处理液中黄曲霉毒素B1的含量为c=24.3 ng/mL。于是其标准不确定度u(c)为：

2.4 回收率（f）的不确定度

如前所述，该方法测定黄曲霉毒素B1，需经样品的称量、提取、净化、淋洗、定容等步骤后再进行仪器分析测试。在该过程中，每一步的操作都会引入误差，要逐步分析其对总不确定度的贡献是相当困难的，结合实际工作认为，可用检测过程中的有关数据如回收率统一评定不确定度。本实验对样品进行10次平行测试，根据10次结果进行计算，回收率结果见表2。

表2 回收率结果统计

按JJF 1059.1—2012中4.1方法，由贝塞尔公式计算得出单次测量实验标准偏差：

3 测量不确定分量汇总表（表3）

表3 测量不确定分量汇总表

4 合成标准不确定度

试样中黄曲霉毒素B1含量的平均值为X= 3.10 μg/kg，最后得到uc(X)=ucrel(X)×X=0.066×8.10= 0.53 μg/kg。

5 扩展不确定度

取包含因子K为2，扩展不确定度U(X)=0.53× 2=1.06 μg/kg。

6 不确定度报告

试样中黄曲霉毒素B1含量为3.10 μg/kg，标准要求保留小数点后2位，所以新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1含量不确定度报告为：3.10 μg/kg± 1.06 μg/kg，包含因子K=2。

7 结论

本研究以新疆巴旦木中黄曲霉毒素B1的10次取样测定数据为基础，进行了免疫亲和层洗净化超高效液相色谱法测定黄曲霉毒素的不确定度评定。由此发现，影响方法不确定度的主要因素来源于回收率引入的不确定度，其次是样品最小二乘法标准曲线拟合带来的黄曲霉毒素B1质量浓度的影响，而样品量取等引入的不确定度可忽略不计。因此，在同等实验操作条件下，选用性能稳定的免疫亲和净化柱和科学准确的取样方法是保证黄曲霉毒素B1测定结果准确性的前提。在测试过程中可以从减小主要不确定度的来源进行改进，进而降低测量不确定度，使测试的准确率提高。

一切测试结果都不可避免地产生不确定度，测试结果的可靠性取决于不确定度的大小，只有出具不确定度值，检测结果才完整而有意义。在本检测实例中，黄曲霉毒素B1平均测试结果为3.10 μg/kg，扩展不确定度结果为1.06 μg/kg。黄曲霉毒素B1的浓度为4.16 μg/kg，均未超过国标限量值5.0 μg/kg。可作为新疆巴旦木生产企业在生产过程中的技术指标，为更好地把控生产质量提供质量参考依据。

[1] 李瑞芳,韩北忠,陈晶瑜,等.黄曲霉生长预测模型的建立及其在玉米储藏中的应用[J].中国粮油学报,2008,23 (3)：144-147.

[2] 罗小虎,王韧,王莉,等.黄曲霉毒素检测方法研究进展[J].粮食与饲料工业,2013(10)：54-58.

[3] 许艳丽,鲍蕾,梁成珠,等.黄曲霉毒素检测及其生物防治方法的研究进展[J].安徽农业科学,2007,35(32)：10210-10212.

[4] 中国轻工业联合会.葡萄酒、果酒通用分析方法：GB/T 15038—2006[S].北京：中国标准出版社,2008：21-23.

[5] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品添加剂卫生标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社, 2015.

[6] 袁辉,王建玲,远辉.超高效液相色谱发测定葡萄酒中柠檬酸含量的不确定度评定[J].酿酒科技,2014(5)：33-36.

[7] 韦昌联,卢柳忠,黎贞崇.我国木薯生物质能源产业发展现状与科技需求[J].酿酒科技,2012(7)：108-111.

[8] 全国认证认可标准化技术委员会.实验室质量控制规范食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社,2008.

[9]田瑞红,孙建平.HPLC技术分析测定黄曲霉毒素的研究进展[J].食品研究与开发,2015,36(6)：149-152.

[10] 郭礼强,宫小明,孙军,等.高效液相色谱-质谱法同时测定曲霉菌代谢物中的黄曲霉毒素及其同系物[J]分析试验室,2015,34(6)：677-682.

[11] 张燕,闫磊,戴洋洋,等.葡萄酒中柠檬酸的液相色谱检测[J].食品研究与开发,2012,33(6)：125-127.

[12] 宋卫得,厉雪芹,高尧华,等.高效液相色谱法测定木薯干中黄曲霉毒素B1的不确定度评定[J].酿酒科技,2015 (4)：120-125.

[13] 国家粮食局.小麦粉与大米粉及其制品中甲醛次硫酸氢钠含量的测定：GB/T 21126—2007[S].北京：中国标准出版社,2008.

[14] 于洋,徐春祥,车文军.高效液相色谱法测定奶粉中的三聚氰胺及其不确定度分析[J].食品科学,2010,31(4)：250-253.

[15] 郑怀东,刘学光,关丽.气相色谱法测定河蟹中多氯联苯残留量的不确定度分析[J].食品科学,2011,32(16)：334-337.

[16] 张素娟.气相色谱法测定白酒中乙酸乙酯含量的不确定度分析[J].食品科学,2010,31(2)：151-153.

[17] 张雪波,肖世青,杜先锋,等.基于主成分分析法的安溪铁观音香气质量评价模型的构建[J].食品科学,2012,33 (22)：225-230.

[18] 王旭,龚媛,张同刚,等.基于主成分分析法羊肉火腿香气质量评价模型的构建[J].食品工业科技,2015(21)：122-127.

[19] 韩兴林,潘学森,刘民万,等.云门酱香型白酒风味特征的分析研究[J].酿酒科技,2014(10)：6-8.

[20] 杨春霞,廖永红,刘峻雄,等.牛栏山二锅头酒醅中芽孢杆菌分离鉴定及发酵风味分析[J].食品工业科技,2012 (9)：69-74.

Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Aflatoxin B1in Almond by Ultra Performance Liquid Chromatography

GUO Jinxi1,2and YUAN Hui1,2
(1.Xinjiang Product Quality Supervision and Inspection Institute,Urumqi,Xinjiang 830011;2.National Quality Supervision and Inspection Center ofAgricultural By-products,Urumqi,Xinjiang 830011,China)

The uncertainties in the determination of aflatoxin B1in almond by UPLC were evaluated to provide useful reference for establishing effective quality control methods.According to standards CNAS—GL06 and JJF 1059.1—1999,a mathematical model had been established to assess the uncertainty sources in the determination of aflatoxin B1in almond.Besides,the source of each uncertainty component was analyzed,quantified and synthesized.Finally,the expanding uncertainties were obtained.The results showed that the main factors influencing the uncertainty included sample dilution,sample weighting,curve fitting in the least-squares sense,and sample recovery rates,etc.The uncertainty of this experiment was 1.06 μg/kg.

ultra-performance liquid chromatography;almond;aflatoxin B1;uncertainty

O657.72；TS261.7

A

1001-9286（2017）05-0117-04

10.13746/j.njkj.2016379

2016-12-28

郭金喜（1981-），硕士，工程师。

优先数字出版时间：2017-02-13；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170213.1355.009.html。