黄芪熟地生晒参勾兑型保健黄酒研究

谢杜梅，高 霄，张 蕾，周建弟，蒋予箭

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018； 2.国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴312000）

黄芪熟地生晒参勾兑型保健黄酒研究

谢杜梅1，高 霄1，张 蕾1，周建弟2，蒋予箭1

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018； 2.国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴312000）

以黄芪、熟地、五味子、生晒参、麦冬为原料，确定勾兑型保健酒的最佳提取工艺。采用热水回流提取工艺，以单因素实验和正交实验对保健酒提取工艺因子进行考察，以有效成分总多糖和总皂苷含量作为参考指标。最终确定最佳提取工艺参数为水浴温度70℃，回流提取时间5 h，乙醇含量10%，料液比1∶25。以最优工艺参数提取的保健酒的总多糖提取率为58.92%，总皂苷的提取率为11.20%。

黄芪； 熟地； 保健黄酒； 多糖； 皂苷； 提取工艺优化

随着人们消费意识和生活水平的提高，保健酒市场规模越来越大，中国劲酒、椰岛鹿龟酒、致中和五加皮等龙头企业发展迅速。但是市场上的保健黄酒种类不是很多，还有很大的发展前景。因此，拟研究开发一款具有提高人体免疫力功能的黄酒。

现代药理表明，黄芪中含有的黄芪多糖、皂苷等化合物具有较强的生物活性[1]。艾志琼等[2]的研究表明，黄芪多糖主要作用于多种免疫活性细胞，促进细胞因子的分泌和正常机体的抗体生成。现代药理表明，熟地对造血系统、内分泌、神经系统、心脑血管及免疫系统等均有一定作用[3]。李发盛等[4]的研究表明，熟地多糖具有提高小鼠免疫功能的作用。现代药理研究表明，人参含有人参皂甙等营养物质，具有滋补强壮、提高体力和脑力劳动能力，降低疲劳的疗效[5]。张剑平等[6]的研究表明，生晒参偏于补益气阴，增强机体抵抗力，发挥免疫调节作用。多糖属于天然大分子物质，能够激活免疫细胞，促进细胞因子分泌，从而调节免疫系统，发挥抗肿瘤、抗氧化等作用[7]。人参皂苷是目前研究的热点，已有研究表明，人参皂苷在心血管系统、中枢神经系统、免疫调节、抗白血病等方面均有作用[8]。因此本实验在确定保健黄酒配方原料的基础上，主要选取了多糖和皂苷作为工艺优化的指标。

本研究主要以熟地、黄芪、麦冬、五味子、生晒参为组方，通过热水回流工艺提取中药中的多糖和皂苷等有效成分。先通过水浴温度、回流时间、乙醇含量和料液比4个单因素实验，确定各个因素的最佳水平，然后通过正交实验确定原料中有效成分提取的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

原料：黄芪、熟地、五味子、生晒参、麦冬，杭州胡庆余堂大药房。古越龙山陈三酿15%vol绍兴黄酒，购于当地超市。

耗材及试剂：无水乙醇，苯酚，浓硫酸，香草醛，甲醇，所用试剂均为分析纯；D101大孔吸附树脂，葡萄糖，人参皂苷。

仪器设备：恒温培养箱，循环水真空泵，721可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 总多糖、总皂苷提取流程

将黄芪、熟地、五味子、生晒参、麦冬原料在60℃的烘箱内烘干至恒重，将其粉碎。在不同的水浴温度，回流提取时间，乙醇含量，料液比下进行提取。吸取部分提取液[9]，加入无水乙醇醇析得到粗多糖沉淀，然后用80%vol的乙醇洗涤沉淀，最后沉淀用水溶解并定容。另取部分提取液[10]，于蒸发皿内蒸发后，用水溶解，进行柱分离，收集洗脱液进行显色实验。

1.2.2 多糖含量的测定方法

本实验采用苯酚-硫酸分光光度法测定总多糖含量。多糖经乙醇沉淀分离以后，去除其他可溶性糖及杂质的干扰，再与苯酚硫酸作用生成橙红色化合物，其呈色强度与溶液中糖的浓度成正比，在490 nm波长下比色定量。

葡萄糖标准溶液的配制：精密称取105℃干燥至恒重的对照葡萄糖25.0 mg,加水溶解,定容于250 mL容量瓶中,配制成葡萄糖对照溶液备用。精密吸取葡萄糖对照溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL置于20 mL的干燥试管中,依次加水使体积均为2.0 mL，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓H2SO45.0 mL，充分摇匀,室温放置5 min，沸水浴加热15 min，取出冷却至室温。在490 nm处测定其吸光度值[11]。

样品处理：精密吸取一定量的经过脱蛋白处理定容的样品液,以测定标准曲线同样的方法测其吸光度值，继而求出浓度。

1.2.3 总皂苷含量的测定方法

样品中总皂苷经提取、D101大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条件下，香草醛与人参皂苷生成有色化合物，以人参皂苷Re为对照品，于560 nm处比色测定。

标准溶液的配制：精密称取10 mg人参皂苷Re，放入10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容至刻度，得到浓度为0.50 mg/mL的标准品储备液。精密取上述配好的储备液30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、180 μL置于10 mL的比色管中，水浴蒸干甲醇后，加入8%香草醛乙醇试液0.5 mL，72%硫酸试液5 mL，充分振摇混匀后置于60℃恒温水浴中加热10 min，立即用冰水冷却10 min，摇匀。以试剂做空白，在560 nm波长处测定吸光度[12]。

样品处理：精密量取一定量经过柱分离的样品液，按上述步骤进行实验，在560 nm波长处测量吸光光度值。进而计算出样品皂苷浓度。

2 结果和讨论

2.1 总多糖结果的测定

在实验条件下，以体积（mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标作图，得标准曲线，见图1。

计算公式：总多糖提取率（%）=c×V/m×100。

式中：c，从回归方程中得出的多糖质量（mg）；V，待测样体积倍数；m，中药复合物总质量（mg）。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 总皂苷结果的测定

在实验条件下，以体积（mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标作图，得标准曲线，见图2。

计算公式：总皂苷提取率（%）=c×V/m×100。

式中：c，从回归方程中得出的皂苷质量（mg）；V，待测样体积倍数；m，中药复合物总质量（mg）。

图2 人参皂苷Re标准曲线

2.3 勾兑型黄酒中功能性成分提取工艺优化

在前期预实验的基础上，分别考察水浴温度、回流提取时间、乙醇含量、料液比4个因素对黄芪、熟地、五味子、生晒参、麦冬勾兑型黄酒提取工艺的影响，并以总多糖和总皂苷为主要检测指标。

2.3.1 水浴温度对总多糖和总皂苷的影响（图3、图4）

不同的水浴加热温度对黄芪、熟地、五味子、生晒参、麦冬中的多糖和皂苷的提取率有很大的影响。将料液比1∶20，乙醇含量20%的黄芪、熟地、五味子、生晒参、麦冬室温下过夜浸泡后，改变水浴加热温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，提取4 h后，测定总多糖和总皂苷含量，确定最佳水浴加热温度。测定结果表明，多糖浓度随温度升高而增加，70℃时，提取液中总多糖含量最高，浓度为36.40 mg/mL，但是随着温度的升高，多糖浓度反而降低，可能原因是温度过高导致多糖降解；皂苷浓度随温度升高而增加，90℃时，提取液中总皂苷含量最高，浓度为4.93 mg/mL。

图3 温度对提取液总多糖含量的影响

图4 温度对提取液总皂苷含量的影响

2.3.2 回流提取时间对总多糖和总皂苷的影响（图5、图6）

原料室温下过夜浸泡后进行热水回流提取，水浴温度60℃，乙醇含量20%，料液比1∶20，改变回流时间，设定为2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，测定结果：多糖浓度随提取时间的延长而增加，5 h时最高，浓度为33.57 mg/mL，但是随着时间的延长，多糖浓度反而降低；皂苷浓度在4 h时最高，浓度为4.81 mg/mL。

2.3.3 乙醇含量对总多糖和总皂苷的影响（图7、图8）

原料室温下过夜浸泡后进行热水回流提取，水浴温度60℃，回流时间4 h，料液比1∶20，改变乙醇含量分别为10%、15%、20%、25%、30%，结果表明，多糖浓度在乙醇含量为15%vol时最高，浓度为38.13 mg/mL；皂苷浓度随着乙醇含量的增加而降低，在乙醇含量为10%vol时皂苷浓度最高，为6.32 mg/mL。

图5 回流提取时间对提取液总多糖含量的影响

图6 回流提取时间对提取液总皂苷含量的影响

图7 乙醇含量对提取液总多糖含量的影响

2.3.4 料液比对总多糖和总皂苷的影响（图9、图10）

图8 乙醇含量对提取液总皂苷含量的影响

原料室温下过夜浸泡后进行热水回流提取，水浴温度60℃，回流时间4 h，乙醇含量20%vol，改变料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。结果表明，多糖提取率随着料液比的增加而提高，料液比为1∶30时，多糖提取率最高，为53.52%；皂苷提取率随着料液比的增加而提高，料液比为1∶25时，皂苷提取率最高，为10.85%。

图9 料液比对提取液总多糖含量的影响

图10 料液比对提取液总皂苷含量的影响

表1 正交实验结果

2.4 提取总多糖和总皂苷的正交实验

2.4.1 正交实验设计的结果和分析

在上述实验结果的基础上，选取4因素3水平作正交实验，因素水平及实验结果计算及分析见表1。由极差（R）可知，以多糖为检测指标，各因素影响次序分别为水浴温度（A）＞乙醇含量（D）＞料液比（C）＞提取时间（B），最佳优化组合为A1B2C2D1。以总皂苷为检测指标，各因素的影响次序分别为水浴温度（A）＞料液比（C）＞乙醇含量（D）＞提取时间（B），最佳优化组合为A1B2C2D1。所以综合考虑，提取的最佳工艺是水浴温度70℃，提取时间5 h，乙醇含量10%vol，料液比1∶25。

表2 方差分析表

2.4.2 验证实验

根据正交实验结果进行验证实验，以水浴温度70℃，提取时间5 h，乙醇含量10%vol，料液比1∶25进行提取，测定总多糖的提取率为58.92%，总皂苷的提取率为11.20%。

3 结论

黄芪、熟地、五味子、生晒参、麦冬勾兑型保健黄酒的主要影响因素有水浴温度、提取时间、乙醇含量、料液比。经单因素实验、正交实验和验证实验最终得出最佳提取工艺参数：水浴温度70℃，提取时间5 h，乙醇含量10%vol，料液比1∶25，得到溶液的总多糖提取率为58.92%，总皂苷的提取率为11.20%。

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Production of Healthcare Yellow Rice Wine by Blending with Astragalus membranaceus,Rehmannia glutinosa and Panax ginseng

XIE Dumei1,GAO Xiao1,ZHANG Lei1,ZHOU Jiandi2and JIANG Yujian1
（1.School of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou,Zhejiang 310018;
2.National Engineering Research Center for Yellow Rice Wine,Shaoxing,Zhejiang 312000,China）

In this study,Astragalus membranaceus,Rehmannia glutinosa,Schisandra chinensis,Panax ginseng and Ophiopogon japonicus were used as raw materials to produce healthcare yellow rice wine.The optimum extraction technology was determined to be hot reflux extraction.And the factors influencing the extraction were investigated by single factor test and orthogonal test with total polysaccharides and total saponins as the reference indexes.Finally,the best technical conditions were summed up as follows:water bath temperature at 70℃,reflux extraction time was 5 hours,ethanol content was 10%,and the ratio of raw materials to liquid was 1∶25.Under the above conditions,the total polysaccharide extraction rate was 58.92%and the total saponin extraction rate was 11.20%.

Astragalus membranaceus;Rehmannia glutinosa;healthcare yellow rice wine;polysaccharide;saponins;extraction optimization

TS262.4；TS261.4；TS262.91

A

1001-9286（2017）05-0083-05

10.13746/j.njkj.2017056

食品科学与工程浙江省重中之重一级学科开放基金项目（编号JYTSP20142082）。

2017-03-10

谢杜梅(1992-)，女，硕士。

蒋予箭，E-mail：13357180599@189.cn。

优先数字出版时间：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1022.005.html。