姜黄素通过抑制PI3K/Akt/mTOR促进SiHa细胞自噬

范世珍，陈旭娜，于波海，莫 莉

(深圳市福田区中医院，广东 深圳518034)

姜黄素通过抑制PI3K/Akt/mTOR促进SiHa细胞自噬

范世珍，陈旭娜，于波海，莫 莉

(深圳市福田区中医院，广东 深圳518034)

目的 研究姜黄素素诱导人宫颈癌细胞自噬的机制及对细胞功能的影响。方法 采用10,20,和30 μmol/L姜黄素处理宫颈癌SiHa细胞12 h，随后采用Western-blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路中Akt和mTOR的磷酸化水平。同时采用自噬抑制剂3-MA处理细胞，采用MTT法观察处理前后SiHa细胞活性变化情况；ELISA检测IFN-γ的分泌水平，Western blot检测凋亡相关基因p53，p21和p27表达变化。结果 姜黄素能以剂量依赖性方式抑制Akt和mTOR磷酸化。同时，姜黄素也能抑制SiHa细胞增殖并诱导其分泌IFN-γ。当同时给予3-MA处理后，可明显逆转姜黄素对SiHa生长增殖的抑制作用，同时也能消除姜黄素诱导其分泌IFN-γ。此外，姜黄素也能上调细胞内p53，p21和p27的表达，抑制自噬后，p53，p21和p27表达明显减少。结论 姜黄素可通过抑制PI3K/Akt/mTOR活性诱导SiHa细胞自噬，最终抑制其增殖并诱导其分泌IFN-γ及表达p53，p21和p27。

姜黄素；SiHa细胞；自噬；mTOR；PI3K/Akt

(ChinJLabDiagn,2017,21:0897)

宫颈癌是全球女性第三位常见的恶性肿瘤[1]。流行病学资料显示，我国宫颈癌发病年龄呈现年轻化趋势[2]。根据深圳市的调查发现，其中45%-47%均为未婚女性。人乳头瘤病毒(Human papilomavirus,HPV)感染是宫颈癌的重要病原微生物[3]。尽管目前已经有预防性疫苗问世，但宫颈癌的发生与超过15个型别的HPV感染有关，而现有疫苗覆盖范围有限。此外，目前上市的疫苗如Gardasil和Cervarx价格昂贵，对于中国等发展中国家而言疫苗接种率很低[4]。因此寻求有效的药物控制HPV感染对于宫颈癌的防控来说具有重要意义。姜黄素(Curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄的根茎中提取的一种多酚类物质，研究证明，姜黄素除了具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用外，也可通过多种机制抑制病毒的复制[5,6]。在本课题组的前期研究当中，我们发现姜黄素可能通过诱导SiHa细胞自噬而抑制HPV的复制[7]。由于目前姜黄素抗病毒的研究还处于初始阶段，关于它在诱导SiHa自噬中的确切机制尚不完全清楚。本研究旨在进一步探讨姜黄素诱导SiHa细胞自噬的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂

姜黄素(纯度98%)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。兔抗人磷酸化mTOR和total mTOR、鼠抗人磷酸化Akt及total Akt购自Cell Signaling((Danvers,MA)，鼠抗人β-actin多克隆抗体购自Abcam(Cambridge,UK)。鼠抗人p53，p21及p27多克隆抗体购自Santa Cruz (Dallas,TX)。HPR标记二抗购自北京中山生物技术公司。胎牛血清购自南京森贝伽生物科技有限公司。IFN-γ ELISA试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司。其余分析纯试剂均购自上海生物工程有限公司。

1.2 细胞培养与处理

人宫颈癌细胞系SiHa购自中科院上海细胞库，用含10%热灭活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2以及95%空气的恒温细胞培养箱中培养。细胞传代10-20次后，实验设正常对照组、姜黄素组、姜黄素+3-MA组、3-MA组，分别加入姜黄素和(或2 μmol/L 3-MA)作用0-48 h，随后提取细胞蛋白用于下一步研究。

1.3 细胞蛋白提取与Western blot分析

收集约3×106个SiHa细胞，加入预冷的裂解缓冲液(含1% Triton X-100，1%脱氧胆酸和0.1% SDS)冰上裂解30 min。蛋白浓度采用Bradford加以测定(Bio-Rad，CA，USA)。获取50μg蛋白在12%浓度的分离胶中进行SDS-PAGE，电泳结束后将其转印至硝酸纤维素膜上，并用5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，最后分别加入相应一抗以及二抗，化学发光、显影(Amersham Bioscience，NJ，USA)。

1.4 ELISA检测IFN-γ分泌

SiHa细胞经姜黄素或3-MA处理结束后，将细胞培养物置于-80℃，待其冷冻后再置于室温溶解，连续经过2循环的冻融后使细胞充分裂解，上清中IFN-γ的浓度为细胞分泌和合成的总量。其浓度测定方法按照试剂盒提供的双抗体夹心法进行，最后根据标准曲线计算IFN-γ的总量。

1.5 MTT检测细胞增殖

采用MTT法分析细胞活性。即，培养于96孔板中的SiHa细胞(1×105/mL)，经姜黄素和(或)3-MA作用后，弃培养上清，加入100 μl MTT溶液(将10 μL 10 μg/mL MTT用90 μl培养基稀释)，37℃继续孵育2 h。孵育结束后加入100 μl DMSO溶液，充分震荡以溶解甲瓒，并于570 nm波长处测定其吸光度(μQuant,Bio-Tek)，并计算细胞相对活性，计算公式：处理组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 姜黄素对SiHa细胞Akt磷酸化的影响

SiHa细胞未经姜黄素处理时，细胞内Akt磷酸化水平较高。而经10,20和30μmol/L姜黄素处理后，Akt磷酸化水平明显降低，而总Akt水平无明显变化(图1)。

图1 不同浓度姜黄素对SiHa细胞Akt磷酸化的影响

2.2 姜黄素对SiHa细胞mTOR磷酸化的影响

Westernblot结果也显示，不同浓度姜黄素处理SiHa细胞后，mTOR的磷酸化水平随着姜黄素浓度的递增而逐渐减弱，而细胞内总mTOR无明显变化(图2)

图2 不同浓度姜黄素对SiHa细胞mTOR磷酸化的影响

2.3 姜黄素抑制SiHa细胞增殖与自噬有关

MTT结果显示，不同浓度姜黄素处理可明显抑制SiHa的活性。而采用自噬抑制剂3-MA处理细胞后，可明显消除姜黄素对细胞活性的抑制效应(图3)。

2.4 姜黄素促进IFN-γ分泌与自噬有关

不同浓度姜黄素处理后，可诱导SiHa细胞分泌IFN-γ，并呈一定的剂量依赖性，而给予3-MA处理后，IFN-γ分泌水平明显减少(图4)。

与对照组(0 μmol/L)相比，*P<0.05；与30μmol/L姜黄素相比，#P<0.05

与对照组(0 μmol/L)相比，*P<0.05；与30 μmol/L姜黄素相比，#P<0.05

2.5 姜黄素对凋亡相关基因表达的影响

Western blot结果显示，姜黄素处理也能影响SiHa细胞中抑癌基因p53/p21及p27的表达水平。随着姜黄素浓度的增加，p53、p21及p27的表达水平随之降低，而给予3-MA处理后，可明显削弱姜黄素对p53、p21及p27的诱导作用(图5)。

图5 姜黄素对凋亡相关基因表达的影响

3 讨论

自噬是一种细胞自我修复和更新的生物学过程，细胞可以通过自噬过程来达到细胞内各种成分含量的平衡稳态，从而使细胞保持最佳的活性状态[8]；细胞可以通过自噬过程完成细胞的分化和重塑来适应外在环境的改变及生长过程的演变。目前研究显示，自噬在代谢平衡、抗肿瘤、抵抗微生物等方面发挥生物学作用[9]。自噬是细胞防御和应激调控的重要机制。自噬在病毒感染和机体免疫中起调控作用，自噬过程异常可以导致细胞死亡。许多RNA病毒和DNA病毒感染的细胞都存在自噬现象。自噬在宿主免疫防御中起重要作用，包括内源性病原体的识别、降解、抗原呈递。自噬作为宿主的防御机制，是机体防御病原体入侵的一道重要防线，在感染病毒的细胞中，病毒体和病毒蛋白、核酸均可通过异噬过程(xenophagy)被自噬体包裹并降解、消除[10]。有研究表明，HPV16病毒颗粒可诱导人包皮角蛋白细胞自噬体形成，诱导自噬相关蛋白的表达上调[11]。抑制自噬可以延长HPV16衣壳蛋白的降解，说明HPV16病毒颗粒诱导的自噬，可以通过快速降解病毒衣壳蛋白来抑制角蛋白细胞的感染[12]。另据报道，HPV与宿主细胞相互作用激活PI3K/Akt/mTOR信号途径抑制自噬的发生，有利于HPV早期感染[13]。本课题小组前期实验证实，姜黄素显著抑制在宫颈癌细胞系中HPV E6/E7转录水平，并抑制细胞增殖，这表明姜黄素影响HPV的转录与复制[7]。为了证实PI3K/Akt/mTOR在姜黄素所致自噬中的作用，我们采用Western blot分别检测了Akt和mTOR的磷酸化水平，结果显示未经姜黄素处理时，SiHa中Akt和mTOR磷酸化水平较高，而姜黄素处理后，Akt和mTOR磷酸化均受到抑制。鉴于PI3K/Akt/mTOR是负向调控细胞自噬的经典通路，因此姜黄素可能通过影响PI3K/Akt/mTOR的磷酸化而诱导SiHa细胞自噬。然而姜黄素抑制PI3K/Akt/mTOR通路后通过何种机制参与自噬的发生目前尚未明了，有研究表明，mTOR主要通过其下游分子p70S6K和eIF4E调节Atgl/ULK等自噬相关分子的活性，最终发挥对细胞自噬的负性调控作用[14,15]。

由于HPV可以通过E6蛋白对p53进行降解，从而导致宿主细胞的生物学行为发生改变，因此我们随后研究了姜黄素对SiHa生长增殖的影响，结果发现不同浓度的姜黄素处理后，SiHa增殖水平收到明显抑制。而采用3-MA抑制细胞自噬后，可显著逆转姜黄素对SiHa细胞的抑制效应，这表明姜黄素是通过促进细胞自噬而发挥细胞生长抑制作用。考虑到凋亡与自噬是细胞程序性死亡的两个过程，既相互联系又相互区别[16]，因此我们随后检测了p53、p21和p27的表达水平。结果发现，姜黄素处理虽然能上调p53、p21和p27的表达，但抑制自噬后，可显著消除姜黄素对p53、p21和p27的抑制效应。以上结果表明姜黄素抑制细胞增殖以及上调凋亡相关基因的表达与自噬有关，这与国外研究结果一致。

综上所述，本研究通过证实了姜黄素通过影响PI3K/Akt/mTOR通路的活性而促进SiHa自噬的发生，后者最终通过影响细胞增殖，增强p53和p27抑癌基因活性等一系列活动，从而发挥抗病毒作用。在随后的研究中，我们将对mTOR下游分子开展深入探讨，以进一步明确自噬抑制HPV阳性宫颈癌的分子机制。

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Curcumin inhibits PI3K/Akt/mTOR pathway to induce SiHa cells autophagy

FANShi-zhen,CHENXu-na,YUBo-hai,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TraditionalChineseMedicalHospitalofFutian,Shengzhen518034,China)

Objective This study was designate to investigate the mechanism of Curcumin in the induction of authphagy and cellular function in human cervical cancer cells.Methods The human cervical cancer cell line SiHa was cultured and stimulated with 10,20,and 30 μmol/L of Curcumin for 12 h,the phosphorylated Akt and mTOR was detected by Western blot.Then cells were incubated with the autophagy inhibitor 3-MA,the cell activity was measured by MTT,the secretion of IFN-γ was detected by ELISA,and expression of the apoptosis associated gene p53,p21 and p27 were dectected by western blot.Results Curcumin could inhibit SiHa cells phosphorylation of Akt and mTOR.In addition,curcumin could also inhibit SiHa cells proliferation and secretion of IFN-γ.Pretrement of 3-MA could significantly abrogate Curcumin-induced growth inhibition and IFN-γ production.Furthermore,Curcumin could also up-regulate SiHa cells expression of p53,p21 and p27,and this function could be reversed by 3-MA.Conclusion Curcumin could inhibit PI3K/Akt/mTOR activation to induce SiHa cells autophagy,and eventually decrease the growth activity and promote the secretion of INF-γand expression of p53,p21 and p27.

Curcumin;SiHa cells;autophagy;mTOR;PI3K/Akt

2015年深圳市科技研发资金基础研究资助项目(JCYJ20150331091010278)

1007-4287(2017)05-0897-04

R737.33

A

范世珍，44岁，女，主任技师，从事临床检验研究。

2016-09-21)