全反式维甲酸对川崎病患儿外周血Th17/Treg细胞平衡的影响研究

黎 萍，倪维华，潘 薇，田 婧，郑百红*

(1.吉林大学第二医院 儿科，吉林 长春130041；2.吉林大学基础医学院 免疫学系)

全反式维甲酸对川崎病患儿外周血Th17/Treg细胞平衡的影响研究

黎 萍1，倪维华2，潘 薇1，田 婧1，郑百红1*

(1.吉林大学第二医院 儿科，吉林 长春130041；2.吉林大学基础医学院 免疫学系)

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对川崎病患儿外周血Th17/Treg细胞平衡的影响。方法 研究纳入10名川崎病患儿为病例组，选择10名健康儿童作为对照组，采取外周静脉血后，无菌分离、制备外周血单个核细胞(PBMC)，给予不同浓度ATRA诱导培养PBMC72 h后，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液的细胞因子IL-10、IL-17A、TGF-β以及IL-6水平，实时PCR检测RORγt mRNA和FOXP3 mRNA表达水平，流式细胞术检测Th17/Treg占外周CD4+T细胞百分比。结果 未加ATRA作用下，病例组Th17细胞比例，转录因子RORγt的mRNA表达水平以及相关细胞因子IL-10、IL-17A均高于对照组(P均<0.01)，而Treg细胞比例，FOXP3 mRNA表达水平以及相关细胞因子TGF-β、IL-6低于对照组(P均<0.01)。给予不同浓度ATRA作用后，病例组以及对照组Th17比例、IL-10、IL-17A、RORγt的mRNA均有所下降，而Treg细胞比例、FOXP3 mRNA表达水平、TGF-β、IL-6均有所上升(P均<0.01)。结论 ATRA在体外可促进川崎病患儿外周血Treg分化，同时抑制Th17分化，改变川崎病患儿外周血Th17/Treg失衡状态，该研究为阐明川崎病的免疫学发病机制及探索新疗法提供实验依据以及思路。

川崎病；维甲酸；Th17细胞；Treg细胞；细胞因子

(ChinJLabDiagn,2017,21:0781)

川崎病(KD)是一种主要累及冠状动脉等中小血管的全身性血管炎综合征，多见于6个月至5岁儿童，其发病率有逐年增高趋势[1]。川崎病所致冠状动脉损伤是小儿最常见的获得性心脏病之一，并且可能是成年后缺血性心脏病的危险因素之一[2]。川崎病的病因以及发病机制迄今尚未完全阐明，目前认为川崎病是感染等因素诱发的急性自身免疫性血管炎[3]。有研究表明，急性期KD患儿体内存在Th17淋巴细胞(Th17)和调节T淋巴细胞(Treg)失衡，Th17细胞过度活化、Treg细胞比例降低，这可能是导致KD患儿炎症细胞因子异常增高、冠脉损伤、对静脉注射免疫球蛋白(IVIG)无反应的原因之一[4]。

维甲酸是食物中维生素A在体内代谢后形成的衍生物，在体内发挥作用的维甲酸主要包括全反式维甲酸(ATRA)和9-顺式维甲酸。新近研究表明，维甲酸在体内、外均可抑制Th17细胞的增殖，并促进T细胞转化为Treg；其作用机制是通过直接减少RORγt[5]，以及诱导FOXP3的表达[6]；并且维甲酸在体外促进健康人群的Treg转化[7]。然而，ATRA对川崎病影响的研究尚未见报道。本研究探讨ATRA对川崎病患儿外周血Th17/Treg细胞平衡的影响，将为我们进一步研究川崎病的免疫学发病机制，及探索针对该环节的干预治疗提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究纳入10名临床诊断为川崎病的患儿为病例组，选择10名健康儿童作为健康对照组。所有对象均来自2013年6月-2016年6月在吉林大学第二医院儿科门诊或住院病例。记录两组研究对象的一般资料和临床资料。本研究对象均为IVIG敏感型且无冠状动脉损伤，病例组于确诊当天早7：00至7：30空腹无菌抽取3 ml肘静脉血，对照组以及病例组静脉血均装入无菌肝素抗凝管，充分抗凝后置4℃冰箱保存，2 h内处理。KD的诊断参照美国心脏病学会在2004年制定的诊断标准[2]；IVIG无反应型及敏感型参照中国以及美国诊断标准[1,8]；病例组在确诊时、IVIG治疗后1个月以及2个月分别行心脏超声，排除冠状动脉损伤[9]病例。本研究已由吉林大学第二医院伦理委员会通过；研究方案已经告知研究对象家属，并获得签字同意。

1.2 方法

1.2.1 无菌分离、制备外周血单个核细胞(PBMC) 将含有淋巴细胞分离液的离心管倾斜45°，在距液面约1 cm处，沿管壁缓慢滴入已用等体积RPMI-1640培养液稀释混匀的抗凝血，稀释血液将以2∶1比例悬浮于淋巴细胞分离液液面上，2 000 r/min室温离心15 min。沿管壁吸尽位于第2层的PBMC，移至15 ml离心管中，用2倍体积的培养液稀释混匀后，2 000 r/min离心10 min，可见单个核细胞沉于管底，弃上清，再加入2倍体积培养液稀释混匀，2 000 r/min离心5 min，弃上清；加入培养液0.1 ml，混匀并计数PBMC。

1.2.2 ATRA诱导培养PBMC 全反式维甲酸R2625购于美国Sigma公司，将ATRA溶解于DMSO配成浓度为10 mmol/L的母液，保存于4℃冰箱中。用培养液调整为1×109/L的PBMC细胞悬液。取24孔培养板，设空白对照、低浓度组、中浓度组和高浓度组，各孔ATRA最终浓度为0 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L，每组设4个复孔，取50 μl 10%植物血凝素和200 μl的PBMC悬液加入各孔，同时取ATRA制剂0 μl、50 μl、100 μl、200 μl，分别加入各组，用培养液调整各孔总容量为1 ml。细胞孵箱培养72 h后离心收集培养液上清，置于-80℃保存待测。收集细胞用于流式细胞仪检测以及实时PCR。

1.2.3 培养上清液中IL-17、IL-10、TGF-β及IL-6含量检测 IL-17、IL-10、TGF-β及IL-6的ELISA试剂盒为美国eBioscience公司产品，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清中IL-17、IL-10和TGF-β及IL-6含量，以标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，利用MPM软件绘制标准曲线并获取曲线方程，然后按曲线方程计算各样本的浓度。

1.2.4 Treg细胞流式检测 重悬、洗涤离心后按106个细胞加入CD4-FITC、CD25-APC流式抗体染色，4℃混匀、染色，洗涤细胞两遍，离心弃上清；加入破膜液500 μl破膜与固定，4℃孵育30 min；然后加入终止液，离心，再用终止液重悬计数并洗涤一遍。重悬细胞沉淀并向其中按照106个细胞，加入FOXP3-PE流式抗体进行核内染色。4℃混匀1 h，然后用破膜终止液洗涤两遍，终止液重悬细胞，过滤细胞，用流式细胞仪检测CD25+FOXP3+T细胞在CD4+T细胞中所占比例。

1.2.5 Th17细胞流式检测 细胞检测前需向细胞培养液中加入细胞刺激混合液(加蛋白转运抑制剂)进行刺激4.5 h-5 h，洗涤破膜同Treg细胞处理方式。破膜前只标记CD4-FITC流式抗体，破膜后加入IL-17A-PE和RoRγt-Alexa Fluor647进行胞内和核内标记；4℃混匀1 h，然后检测RoRγt+IL-17A+T细胞在CD4+T细胞中所占比例。

1.2.6 实时PCR检测mRNA表达水平 取上述培养细胞，分离总RNA，采用逆转录系统逆转录RNA，使用罗氏荧光定量仪检测，应用软件进行分析，结果以待测基因β-actin的比值表示。FOXP3引物为：5′-CACGCATGTTTGCCTTCTTCAGA-3′，5′- GTAGGGTTGGAACACCTGCTGGG-3′，RORγt引物为：F:5′-TCAGTCATGAGAACACAAATTGA-3′，R:5′-GCACCCCTCACAGGTGATAA-3′；β-actin 引物：5′- ATCTGGCACCACACCTTC -3′,5′ - AGCCAGGTCCAGACGCA -3′。逆转录和PCR试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 一般资料

病例组10例川崎病患儿中男女比为7∶3，年龄范围为2.24-5.87(4.37±1.01)岁；健康对照组10例，其中男女比为7∶3，年龄范围为2.48-5.29(4.67±1.16)岁，两组年龄、性别构成比无统计学差异。

2.2 ATRA对CD25+FOXP3+T/CD4+T百分比以及RORγt+IL-17A+T/CD4+T百分比的影响

流式细胞仪检测结果显示，未加ATRA作用下，病例组Th17(RORγt+IL-17A+T)细胞比例高于对照组，Treg(CD25+FOXP3+T)细胞比例低于对照组(P均<0.01)。病例组中，低、中和高浓度ATRA组PBMC培养Th17比例显著低于空白对照组(P均<0.01)，而中、高浓度组无显著差异(P>0.05)。健康对照组中，不同浓度ATRA作用下，Th17细胞比例会下降，显著低于空白对照组(P均<0.01)。健康对照组以及病例组中，低、中和高浓度ATRA组 PBMC培养Treg细胞，Treg细胞比例均有所上升(P均<0.01)。结果如表1所示。

表1 ATRA干预后Th17、Treg细胞占外周血 CD4+T 细胞比例的比较

a:与空白对照组比，P<0.01；b:与低浓度组比，P<0.01；c：与中浓度组比，P<0.01。

2.3 ATRA对PBMC分泌IL-10、TGF-β、IL-17A和IL-6水平的影响

未加ATRA作用下，病例组PBMC分泌的IL-10、TGF-β低于对照组。经过低、中和高浓度ATRA作用后，病例组和健康对照组PBMC分泌的IL-10、TGF-β均显著升高，IL-17A和IL-6水平高于对照组(P均<0.01)。结果如表2、3所示。

表2 ATRA干预后PBMC分泌IL-10和TGF-β水平

a:与空白对照组比，P<0.01；b:与低浓度组比，P<0.01；c：与中浓度组比，P<0.01。

表3 ATRA干预后PBMC分泌IL-17A、IL-6水平

a:与空白对照组比，P<0.01；b:与低浓度组比，P<0.01；c：与中浓度组比，P<0.01。

2.4 ATRA对川崎病外周PBMC中FOXP3 mRNA、RORγt mRNA表达水平的影响

未加ATRA作用下，病例组RORγt mRNA表达水平高于对照组，FOXP3 mRNA低于对照组(P均<0.05)。病例组以及健康对照组中，低、中和高浓度ATRA组PBMC培养RORγt mRNA表达水平显著低于空白对照组(P均<0.01)，病例组中、高浓度组之间无显著差异(P>0.05)。健康对照组中，中浓度组RORγt mRNA表达水平与低浓度组无统计学差异(P<0.05)。病例组不同浓度ATRA组之间，FOXP3 mRNA水平无统计学差异(P>0.05)；而健康对照组中浓度组FOXP3 mRNA水平高于低浓度组以及高浓度组(P均<0.05)。如表4所示。

表4 外周PBMC中FOXP3、RORγt的mRNA表达水平

a:与空白对照组比，P<0.01；b:与低浓度组比，P<0.01；c：与中浓度组比，P<0.01。

3 讨论

ATRA能通过细胞核上多种受体产生广泛的生物学效应，如抑制外源性凝血、抑制细胞迁移、诱导细胞分化[10]。研究发现，ATRA参与天然T细胞转化为Treg细胞的过程[11]。在维甲酸和TGF-β1共同培养体系中，T细胞表现出很强的免疫抑制功能，这可能与FOXP3表达的增加有关；而RA受体的抑制物能够抑制FOXP3的表达，说明FOXP3的表达受到内源性维甲酸以及维甲酸受体的正调节[12]。研究表明[4]，川崎病患儿Treg细胞表达水平和抑制功能明显降低，而Th17细胞表达显著升高。Th17细胞在自身免疫中发挥促炎作用，RORγt 是Th17分化的特异性转录因子，它能诱导编码IL-17的基因转录，促使CD4+T分化为Th17细胞，并分泌IL-6、IL-17A等促炎因子[13]。本研究中，ATRA处理川崎病患儿外周有核细胞后，各组Treg表达和分泌细胞因子明显增加，而Th17水平明显下降；由于CD4+T细胞比例在对照组和处理组均无明显变化，从而排除了CD4+T细胞比例改变对Treg和Th17细胞表达水平的影响。未加ATRA作用下，病例组Th17比例、RORγt的mRNA表达水平均高于对照组，而Treg细胞比例、FOXP3 mRNA表达水平低于对照组(P均<0.05)。给予不同浓度ATRA作用后，病例组以及对照组Th17比例均有所下降；低、中等和高浓度ATRA组 PBMC培养Treg细胞，Treg细胞比例均有所上升(P均<0.05)。本研究通过检测ATRA对川崎病患儿Treg和Th17细胞数量和分泌细胞因子的影响，发现ATRA可上调Treg表达，同时降低Th17水平，有效改变川崎病Th17/Treg失衡状态。但是，ATRA是否可通过作用于Treg和Th17细胞分化，影响Th17/Treg平衡，应用于川崎病的治疗？尚需进一步动物实验来观察、验证。

ATRA可改变Th17/Treg平衡失调，能够恢复Th17/Treg平衡状态，对川崎病的诊治具有重要意义。因此，深入研究Th17/Treg失衡及其机制和ATRA对平衡的影响，为我们进一步研究川崎病的免疫学发病机制，及为开发治疗川崎病药物提供新的思路。

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The effect of all-trans-retinoic acid on the balance of Th17/Treg in the peripheral blood of patients with Kawasaki disease

LIPing，NIWei-hua，PANWei，etal.

(DepartmentofPediatrics,SecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China)

Objective To examine the effect of all-trans-retinoic acid(ATRA) on the balance of Th17/Treg in the peripheral blood of patients with Kawasaki disease.Methods Peripheral venous blood samples were obtained from 10 children with Kawasaki disease and 10 healthy children as control.The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated aseptically,and the cells were cultured with different concentrations of ATRA for 72 hours.Plasma levels of Th17- and Treg-related cytokines including IL-17A,IL-10,IL-6,TGF-β in cell supernatant and mRNA expression levels of RORγt and FOXP3 were tested using ELISA and real time PCR,respectively.Flow cytometry was used to detect the percentage of Th17/Treg in CD4+ T cells.Results Without effect of ATRA,PBMC from patients with Kawasaki disease had higher levels of Th17 percentage,IL-17A,IL-10 and RORγt mRNA (P<0.01) when compared to the control group.ATRA resulted in a reduction in Th17 percentage,IL-17A,IL-10 and RORγt mRNA (P<0.01) and an increase of Treg percentage,IL-6,TGF-β and FOXP3 mRNA in PBMC from patients with Kawasaki disease and control group(P<0.01).Conclusion ATRA could promote Treg differentiation of peripheral blood in children with Kawasaki disease in vitro,and inhibit Th17 differentiation.The Th17/Treg imbalance in peripheral blood of children with Kawasaki disease was changed by ATRA in vitro.Our findings provide further evidence for the immune pathogenesis and therapy of Kawasaki disease.

Kawasaki disease;retinoic acid;T-helper 17 cells;regulatory T cells;cytokines

吉林省科技厅青年基金资助课题(20140520022JH)

*通讯作者

1007-4287(2017)05-0781-05

R725.4

A

2016-10-27)