骨碎补醇提物对维甲酸致小鼠骨质疏松模型的影响

赵兴亚+钱海兵

摘要：目的 研究骨碎补醇提物对用维甲酸诱导的小鼠骨质疏松模型的影响。方法 采用维甲酸灌胃造成小鼠实验性骨质疏松症模型，同时灌胃低、中、高3种计量的骨碎补醇提物，14 d后测定血清钙、磷含量及碱性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶的活性（TRAP）的活性，以及血清中骨钙素（BGP）和雌二醇（E2）的含量。结果 维甲酸可引起小鼠骨质疏松，骨碎补醇提物可升高E2的数值，同时降低碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素的水平。结论 骨碎补醇提物对于维甲酸造成的骨质疏松症模型有一定的预防作用。

关键词：骨碎补醇提物；维甲酸；骨质疏松；小鼠

骨质疏松症（OP）是一种以骨量减少、骨组织微结构异常为特征，致使骨骼脆性增加、极易发生骨折的一种全身性代谢性骨骼系统疾病[1]，随着人口老龄化的持续发展，骨质疏松的发病率目前在常见疾病和多发病中居于第七位，已经严重影响中老年人群的健康生活，临床上西药治疗骨质疏松的药物并不多，且大多治疗靶点过于单一，毒副作用较强[2]。我国是中药大国，拥有丰富的中草药资源，且中药治疗骨质疏松也已有上千年历史，中药具有疗效明显、价格低廉、毒副作用小等优点，必定会成为研究防治骨质疏松症的新渠道和新方向。

骨碎补为水龙骨科多年生蕨类植物槲蕨 Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm的干燥根茎，其性温、味苦具有补肾活血、止血续伤等功效，为骨科常用药[3]。近代的药理学研究也表明骨碎补具有补肝肾、强筋骨的作用[4]。同时也发现骨碎补醇提物可促进成骨细胞的增殖、分化以及矿化[5-6]，从而起到防治骨质疏松的作用。目前，单纯研究骨碎补醇提物对骨质疏松症影响的研究较少。本实验观察不同剂量骨碎补醇提物对维甲酸致骨质疏松小鼠的影响，从而探寻其可能产生的影响。

1 材料与方法

1.1动物 昆明种小鼠6～8 周龄，体重（25±5） g，雌雄各半，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（渝）2012-0001。

1.2药物及试剂 骨碎补药材及其提取液制备：骨碎补购自北京同仁堂（贵阳药店），经贵阳中医学院王祥培副教授鉴定。取骨碎补药材粉末3 kg，12倍量75%乙醇回流提取3次，滤过合并滤液，减压回收至干，通过预实验加 0.5% CMC-Na 配成所需浓度（30、60、120 mg/kg）的灌胃剂（HPLC测得柚皮苷质量分数为0.74%），制备完毕后置4℃保存备用[7]。全反式维甲酸（retinoicacid，RA，山东良福制药有限公司，纯度为101.4%）；维生素D3注射液（VD3，上海通用药业股份有限公司）；钙、磷、碱性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；骨钙素（BGP）、雌二醇（E2）放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

1.3仪器 BT815A型半自动生化分析仪（上海三科仪器有限公司）；SN 695型放射免疫计数器（上海日环仪器厂）。

1.4分组及造模 将60只小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半，分别为空白组、模型组、骨碎补醇提物低、中、高剂量组及阳性药VD 3组。所有实验动物饲养条件一致，适应性饲养1 w后，于每日上午空白组灌纯净水外，其余各组小鼠均灌胃给予RA 90 mg/kg，连续14 d。在造模的同时，VD 3组及骨碎补醇提物各剂量组每天下午给予不同浓度的受试药。各组给药容积均为0.02 ml/g，给药期间隔天称量体重以调整给药量。停药次日，小鼠摘眼球取血。

1.5检测指标 血清生化及相关激素指标：血清钙、磷、ALP、TRAP检测步骤均按照试剂说明书进行。血清BGP、E2含量用放射免疫法测定。

1.6统计学处理 各项参数均表示为（x±s），采用SPSS13.0统计软件进行分析，多组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1对血液生化指标的影响 同空白组比较，模型组血钙水平下降，用药后血钙水平可见升高，但与模型组比较无显著性差异；模型组s-P，s-ALP，s-TRAP显著升高（P<0.05），骨碎补醇提物的中剂量和高剂量组与模型组相比显著降低（P<0.05，P<0.01），见表1。

2.2对骨代谢相关激素水平的影响 模型组小鼠s-BGP水平明显高于空白组（P<0.05），而VD3组及骨碎补醇提物各剂量组能降低s-BGP水平，但与模型组比较无统计学差异。与空白组比较，模型组s-E2水平下降，骨碎补醇提物各剂量组使体内s-E2水平上升，特别是骨碎补醇提物的高剂量组升高明显（P<0.05），见表2。

3 讨论

骨代谢和骨转换的过程是成骨细胞形成新骨和破骨细胞吸收旧骨的过程。原发性骨质疏松症正是由于骨重建单位中骨形成与骨吸收这一平衡被破坏而产生的[8]。用维甲酸诱导所致的小鼠骨质疏松模型在发病的症状以及对雌激素的骨反应上都与人类有较好的相似性，是研究骨质疏松症的一个较好的造模方法[9]。VD3被公认为目前预防及治疗骨质疏松症的一线药物。在本次实验中可以看到VD3并不能显著提高小鼠体内雌激素水平，说明其防治骨质疏松的作用机制可能与激素无关。本实验模型组小鼠s-ALP及s-TRAP水平均明顯升高，这表明维甲酸既可以促进成骨细胞的增殖和分化，又可以增加破骨细胞的骨吸收，造成高转化型骨质疏松症。应用骨碎补醇提物，特别是骨碎补醇提物高剂量组可显著降低小鼠血清ALP及TRAP含量，提示该药可在一定范围内可抑制骨吸收，减少骨丢失。另外，与空白组比较，模型组血钙降低而血磷升高，则进一步说明维甲酸诱导骨代谢活跃、骨转换率升高。而各给药组血钙、血磷逐步趋于正常，这可能与药物促进胃肠道对钙磷的吸收有关。骨钙素（BGP）水平增高，多见于高转换型骨质疏松症[10]。本实验造模后小鼠呈高转换型骨质疏松，给小鼠灌服骨碎补醇提物后骨转换水平下降。雌激素对骨代谢的调节是复杂的，多途径的，既有促进作用，又有抑制作用[11]。实验中发现模型组雌二醇水平明显降低，这也与维甲酸导致性腺损伤的报道一致。骨碎补醇提物用药组体内雌二醇水平有不同程度的升高，特别是高剂量组较明显，从而证实骨碎补醇提物具有类雌激素样作用。

综上所述，骨碎补醇提物能够提高血清雌激素水平、抑制骨高转换率，使骨代谢趋于平衡，对维甲酸诱导的小鼠骨质疏松症具有一定的预防作用。

参考文献：

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[2]宋双红，余倩，王喆之，等.骨碎补防治骨质疏松研究概况[J].生命的化学，2015，35（1）：73-80.

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[6]Li F，Meng F，Xiong Z，et al.Stimulative activity of Drynaria fortunei （Kunze） J.Sm.extracts and two of its flavonoids on the proliferation of osteoblastic like cells[J].Pharmazie，2006，61（11）：962.

[7]張上上，刘心晏，郑姝宁，等.骨碎补醇提物对骨质疏松预防作用的大鼠尿液UPLC-MS/MS代谢组学研究[J]中国中药杂志.2012，01：658-662.

[8]陈琦，薛存宽，沈凯，等.红车轴草异黄酮对去势大鼠骨质疏松影响的实验研究[J].中国医师，2005，8（7）：538-540.

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[10]Raff H，Raff J L，Duthie E H，et al.Elevated Salivary Cortisol in the Evening in Healthy Elderly Men and Women：Correlation With Bone Mineral Density[J].Journals of Gerontology，1999，54（9）：S24.

[11]周振雷，侯加法.雌激素对骨代谢的调节作用[J].中国临床康复，2004，8（14）：2714.

编辑/成森