维甲酸对胎鼠骨骼致畸作用的研究

韩继卫, 李秋霞, 夏 鹏, 孙 苗, 王冰烃, 郑大恒

绍兴文理学院生命科学学院, 浙江 绍兴 312000

维生素A(vitamin A)又称视黄醇，是脊椎动物胚胎时期细胞增殖、生长和分化的重要信号分子。动物通过食物摄入维生素A，并经过两步脱氢氧化为维甲酸(retinoic acid，RA)，维甲酸在生物体内异构酶的作用下以全反式维甲酸 (alltrans retinoic acid, ATRA)和顺式维甲酸 (cis-retinoic acid, cis-RA)的形式存在[1,2]。研究表明，全反式维甲酸能够诱导成骨细胞、骨髓基质细胞、干细胞等细胞的分化以及骨代谢相关基因的表达，参与骨骼的发育与代谢[3]。当其缺乏时，它会破坏成骨细胞与破骨细胞之间的平衡，引起骨质增殖或骨质不吸收，孕妇如果缺乏维甲酸会直接影响胎儿发育，甚至发生死胎[4]。然而在1953年，Cohlan[5]报道了孕鼠摄入过多维生素A导致胎鼠露脑等多种畸形。随后的实验研究也证实，过量的维甲酸对脊椎动物以及胎儿有致畸作用[6～8]。已有研究发现不同剂量的维甲酸对小鼠胎鼠的致畸效果不同[9,10]。然而关于不同孕期维甲酸诱导的胎鼠畸形的机理研究较少，且不同的学者对于维甲酸引起骨骼畸形的代谢机理观点不尽一致，因此本文探究了不同剂量、不同孕期维甲酸对小鼠胚胎生长发育的影响，并试图从基因层面初步探究维甲酸的致畸机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

ICR小鼠购于浙江省实验动物中心，经饲养观察3 d后用于实验；实验动物实验程序按本校实验动物伦理规范(2013051201)执行。

1.2 主要试剂与仪器

全反式维甲酸购于上海第六制药厂，批号 01007；阿利新蓝、茜素红购于Amresco公司； RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒购于Bio-Rad公司；橄榄油购于中粮集团；甘油、丙酮等购于国药集团，分析纯。

主要仪器：体式显微镜(Nikon，日本)；台式高速低温离心机(Sigma，德国)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)。

1.3 方法

1.3.1维甲酸对胎鼠的致畸作用 ①不同剂量的维甲酸对胎鼠的致畸作用。取孕鼠16只，随机分成4组，设置3个实验组(ATRA-橄榄油悬液，灌胃)和1个溶剂对照组(橄榄油，灌胃)。实验组在小鼠妊娠11.5 d 分别灌胃10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的ATRA-橄榄油悬液。在怀孕18.5 d，剖腹，取出胚胎，染色并测定相关指标。

②维甲酸对不同孕期的小鼠胚胎的致畸作用。取孕鼠16只，随机分成4组，设置3个实验组(ATRA-橄榄油悬液，灌胃)和1个溶剂对照组(橄榄油，灌胃)。实验组分别在小鼠怀孕的7.5 d、11.5 d 和 15.5 d 以50 mg/kg的剂量灌胃ATRA-橄榄油悬液。在怀孕18.5 d，剖腹，取出胚胎，染色并测定相关指标。

1.3.2胎鼠骨骼染色 取胎鼠，95%酒精固定45 min，去除全身皮肤、皮下脂肪、内脏，重新置于95%酒精中固定36 h。然后置于丙酮中脱脂36 h，将脱脂后的标本分别置于0.017%茜素红、0.025%阿利新蓝中，37℃各染色1 d。将染色后的骨骼置于20%甘油中平衡1 h，再置于20%甘油与1% KOH混合的透明液中透明3 d。标本保存于20%甘油中[11,12]，体式显微镜下观察骨骼发育情况，测量骨骼长度。

1.3.3胎鼠的RNA提取与RT-PCR 按照试剂盒提取胎鼠总RNA，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行荧光定量扩增。PCR的反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，40个循环。以GAPDH(上游引物:5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′)为内参基因，分析Cyp26b1(上游引物：5′-CTGGCTGCTACAGGGTTCTG-3′，下游引物：5′-CTCGCCCATGAGGATCTTGC-3′)基因的表达水平。

2 结果与分析

2.1 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢骨骼发育的影响

2.1.1不同剂量维甲酸对胎鼠四肢长骨发育的影响 由图1可见，在怀孕第11.5 d灌胃不同剂量的维甲酸对小鼠体内胎鼠的致畸作用主要表现在四肢骨骼上。胎鼠四肢长骨均普遍短于对照组，并且随维甲酸剂量的升高不断缩短(图1A)，这说明维甲酸对小鼠四肢骨骼发育有抑制作用。并且维甲酸对胎鼠长骨的成骨部分抑制影响尤为剧烈，随着维甲酸剂量的升高，四肢长骨的成骨部分缩短明显(图1A、B)。在维甲酸作用下，小鼠的桡骨、尺骨、股骨、胫骨、腓骨均表现出成骨骨化缺失(图1B、C)，这表明维甲酸对胎鼠四肢骨骼发育的抑制作用主要影响骨骼的骨化过程。

2.1.2维甲酸对胎鼠四肢手(足)骨发育的影响

由图2可见，在怀孕第11.5 d灌胃不同剂量的维甲酸，对小鼠四肢手(足)骨发育的统计，手指骨和足趾骨影响较大(图2B)，伴随着维甲酸作用剂量的上升，胎鼠指(趾)骨的分化逐渐减弱(图2A)，当灌胃量达到50 mg/kg以上时，出现少指(趾)、并趾、跗骨缩短甚至愈合的现象(图2B)，这说明在孕期11.5 d，一定剂量的维甲酸可以干扰骨骼的分化。

图1 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢长骨发育的影响Fig.1 The effects of different doses of ATRA on long bone of limbs in fetal rat.A.不同剂量维甲酸作用下小鼠整体骨骼、四肢骨骼染色图(1为肱骨，2为桡骨和尺骨，3为股骨，4为胫骨和腓骨，红色代表成骨，蓝色代表软骨)；B.不同剂量维甲酸作用下小鼠长骨(肱骨、桡骨、尺骨)的成骨长度；C.不同剂量维甲酸作用下小鼠长骨(股骨、胫骨、腓骨)的成骨长度。*与**表示，对照组相比在P<0.05和P<0.01水平上差异显著。

图2 不同剂量维甲酸对胎鼠四肢指(趾)骨发育的影响Fig.2 The effects of different doses of ATRA on bone of fingers and toes in fetal rat.A．畸形趾骨(1为少趾，2为并趾，3为跗骨缩短或愈合)；B. 不同灌胃剂量对胎鼠指(趾)数的影响；C. 不同灌胃剂量对胎鼠跗骨长的影响。**表示与对照组(0 mg/kg组)相比在P<0.01水平上差异显著。

2.2 维甲酸对不同孕期胎鼠骨骼发育的影响

由图3可见，在小鼠的不同孕期，维甲酸对胎鼠的致畸程度不同。在孕7.5 d，维甲酸可引起胎鼠尾椎缩短变形或无尾椎、胸肋骨发育异常等现象(图3B)；在孕11.5 d，维甲酸主要使胎鼠四肢骨骼发育迟缓，出现四肢长骨的成骨缩短或消失，并抑制指(趾)骨分化；在孕15.5 d，维甲酸对骨骼的致畸作用弱于7.5 d 和11.5 d，但也能在一定程度上使胎鼠四肢长度缩短，指(趾)个数减少，并且影响成骨的骨化。(图3B～E)。

图3 维甲酸对不同孕期小鼠骨骼发育的影响Fig.3 The effects of ATRA on bones in different pregnancy time of mice.A.小鼠整体骨骼染色图；B.不同孕期维甲酸的致畸作用，1为胸肋骨异常，2为尾椎消失，3为桡骨、尺骨缩短，4为后肢发育异常，5为成骨骨化不完全；C、D、E.灌胃时间对胎鼠尾长、前后肢长、指(趾)数的影响。**表示与对照组相比在P<0.01水平上差异显著。

2.3 维甲酸对胎鼠Cyp26b1基因表达水平的影响

Cyp26属于细胞色素P450超家族成员, 它能编码特异代谢维甲酸的氧化酶，Cyp26家族有3 种亚家族成员, 即Cyp26a1、Cyp26b1和Cyp26c1[13]。研究表明，CYP26B1是骨骼发育的主要维甲酸代谢酶，它可以降解过量的维甲酸，从而抑制维甲酸的致畸作用[14,15]。而本研究通过荧光定量PCR检测发现，在孕期11.5 d，给予10 mg/kg的维甲酸对胎鼠Cyp26b1基因表达的影响不大，与对照组比较无显著差异(P>0.05)，当给予50 mg/kg和100 mg/kg维甲酸时，胎鼠Cyp26b1基因表达下降，与对照组比较差异极显著(P<0.01)(图4A)。

当控制维甲酸的给予剂量为50 mg/kg 时，不同孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)对维甲酸在Cyp26b1基因水平上的反应也不相同，随着孕期天数的增加，胎鼠体内Cyp26b1基因表达水平上升，但Cyp26b1基因的相对表达量都低于对照组(P<0.01)，这说明一定剂量的维甲酸能够抑制孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)内胎鼠Cyp26b1基因的表达(图4B)。

图4 维甲酸对胎鼠Cyp26b1基因表达水平的影响Fig.4 The effects ofCyp26b1gene expression levels on fetal rat.A.不同剂量维甲酸对胎鼠Cyp26b1基因表达水平的影响；B.维甲酸对不同孕期胎鼠Cyp26b1基因表达水平的影响。**表示与对照组相比在P<0.01水平上差异显著。

3 讨论

维甲酸是维生素A 在体内代谢的中间产物，过量的维甲酸对大鼠、仓鼠、鸡等动物具有致畸性[16～18]。梁天琦[19]用50 mg/kg维甲酸诱导BALB/c小鼠，制作腭裂模型；夏敏杰等[10]研究发现50 mg/kg维甲酸对SD 大鼠胚胎具有明显的致畸作用；陈默等[9]研究发现80 mg/kg维甲酸是造成小鼠胚胎典型畸形的最佳灌胃剂量。本研究也发现10 mg/kg的维甲酸对胎鼠的四肢、指(趾)数影响较小(图1)，当维甲酸的剂量达到50 mg/kg和100 mg/kg时，小鼠胚胎四肢、指(趾)数出现畸形，与对照组比较差异显著(P<0.05)。

对于不同孕期的小鼠，维甲酸的致畸效果也不同。当孕期为7.5 d时，维甲酸主要导致尾椎骨、胸肋骨骨骼的畸变；当孕期为11.5 d时，维甲酸则能使四肢骨骼发育迟缓、抑制指(趾)骨分化；当孕期为15.5 d时，维甲酸对骨骼的致畸作用减弱，主要表现为干预成骨的骨化。这可能是由于在孕娠的不同时间，骨骼发育的次序不同，在7.5 d时主要是胎鼠椎骨和胸肋骨发育时期，此时维甲酸的过量摄入必然导致这些骨骼的发育异常；而当11.5 d时胎鼠四肢骨发育活跃，过量的维甲酸会导致这些骨骼的畸变；当15.5 d时胎鼠的骨骼基本发育完全，因而维甲酸对胎鼠的致畸作用减弱，但此时成骨的骨化还未结束，因而在这一时期维甲酸主要抑制成骨骨化。

CYP26B1细胞色素酶是体内调节维甲酸水平的关键酶，它能够分解代谢维甲酸，在对不同底物代谢效率的竞争性研究中发现，CYP26B1的首选作用底物是反式维甲酸[20]，CYP26B1细胞色素酶在体内的表达量受Cyp26b1基因调控[21]。本研究发现随着维甲酸剂量的提高，Cyp26b1基因表达水平会下降，当维甲酸给予剂量为50 mg/kg和100 mg/kg时，Cyp26b1基因表达量与对照组比较差异极显著(P<0.01)；同时50 mg/kg维甲酸也会引起不同孕期(7.5 d、11.5 d 和 15.5 d)胎鼠体内Cyp26b1基因表达水平下降(P<0.01)。Cyp26b1基因水平的降低是否引起CYP26B1蛋白酶表达量的下降，CYP26B1蛋白表达量改变后是否改变对维甲酸的降解，从而加深维甲酸的致畸作用，这些都有待于进一步研究。

总之，维甲酸灌胃各组孕娠小鼠，胎鼠骨骼均有不同程度和不同频率的变短、变小、畸形、缺失以及骨化延迟的现象出现，并且这种畸变随着维甲酸的给予剂量和小鼠孕期天数的不同而不同，同时维甲酸能够降低与维甲酸降解酶相关的Cyp26b1基因的表达水平。