硫代巴比妥酸法测定鱼体肌肉中脂质过氧化物含量的方法优化

祁红学 刘秀萍 安静

摘要[目的] 优化鱼体肌肉组织中脂质过氧化物（LPO）含量的测定条件。[方法] 使用硫代巴比妥酸分光光度法测定LPO含量，设计乙酸用量、十二烷基磺酸钠（SDS）用量、处理时间和温度4因素3水平的正交试验，考察各因素水平组合对鱼体肌肉中LPO含量测定的影响，优化测定条件。[结果]各因素对LPO含量测定结果的影响由大到小依次为SDS用量、乙酸用量、温度、处理时间；通过直观分析和方差分析，得出最优组合为A3B1C3D2 ，即测定的最优组合为20%的乙酸，65 ℃水浴中保持60 min。[结论]该研究可为鱼类氧化应激损伤研究提供方法支持。

关键词脂质过氧化；分光光度法；正交试验

中图分类号TS207.3文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）10-0091-02

Improvement of Thiobarbituric Acid Reaction for the Dertermination of Lipid Peroxidation in the Muscles of Fish

QI Hongxue，LIU Xiuping，AN Jing*（College of Chemistry and Chemical Engineering，Jinzhong University，Jinzhong，Shanxi 030619）

Abstract[Objective] To improve the optimum condition for measuring the lipid peroxidation （LPO） in the muscles of fish.[Method] The LPO was determined using spectrophotometer with thiobarbituric acid.The orthogonal design with four factors and three levels was conducted to evaluate the level of LPO in the cyprinoid fish.Four factors were included the gradient of acetic acid，sodium dodecyl sulfate，time and temperature，respectively.[Result] The weight sequence was known as SDS，the gradient of acetic acid，temperature，time by comparing the difference of each factor.The results indicated that the optimum group was A3B1C3D2 by visual analysis and variance analys，namely 20% acetic acid，65 ℃ water bath，60 min.[Conclusion] The study can support the research on the demage of oxidative stress in fish.

Key wordsLipid peroxidation；Spectrophotometry；Orthogonal test

细胞在发生氧化应激反应时，会发生脂质过氧化，该反应是发生于不饱和脂肪酸（UFA）共价键上的一系列自由基反应。机体内由于有很多UFA，因此极易受到氧化作用损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物（LPO）[1]。

目前，对脂质过氧化的研究领域涵盖了肿瘤、感染、衰老、心血管疾病、毒理学等方面[2-3]。测定脂质过氧化的方法有荧光和分光光度法[4]，由于分光光度法操作简单、快速，仍在大量使用，其中硫代巴比妥酸（TBARS）法是最为常用的方法[5]。一些脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸，氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物（如醛和酮类化合物），称之为TBARS反应物。通过检测TBARS反应物的含量来反映LPO的水平，从而表征氧化应激反应对细胞膜的损伤水平[6]。有关此方法优化与改进的报道较多[7-8]，但鲜有专门针对鱼体肌肉组織测定方法的报道，因此，有必要对其测定方法进行优化，以便适应鱼体肌肉组织中LPO含量的测定。

笔者在Ohkawa等[5]的方法基础上，加大三氯乙酸（TCA）的用量[9]，用甲醇代替正丁醇[8]，采用4因素3水平正交试验对鲤鱼肌肉组织液的LPO水平进行测定，4个因素分别为乙酸用量、十二烷基硫酸钠（SDS）用量、处理时间和温度。使用V-1200可见分光光度计测出鲤鱼肌肉酶液的LPO吸光度值，再运用直观分析法和方差分析对LPO的吸光度值进行分析，最终得到鲤鱼肌肉组织中LPO含量的最佳测定条件。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料及主要试剂。硫代巴比妥酸，分析纯，北京化工厂；0.9%NaCl溶液，上海金穗生物科技有限公司；乙酸，分析纯，北京化工厂；鲤鱼，太原市万柏林区市场；SDS，分析纯，北京红星化工科技公司。

1.1.2主要仪器设备。数显恒温水浴锅（HH-6），常州智博瑞仪器制造有限公司；电子天平（WT3003），上海西艾爱电子有限公司；水浴氮吹仪（SHD-003），上海极恒实业有限公司；电动离心机（YXJ-1），江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；可见分光光度计（V-1200），上海美谱达仪器有限公司。

1.2试剂的配制

2%硫代巴比妥酸水溶液：用前加热到70 ℃左右溶解。

10%和20%乙酸：用盐酸调节pH为3.5。

2.5%和5.0% SDS水溶液：称取2.5和5.0 g 的SDS，分别溶于100 mL 蒸馏水中，混匀后所得溶液就是2.5%和5.0% SDS工作液。

1.3鲤鱼肌肉中LPO含量测定的正交试验设计

选取的4个因素分别为乙酸用量、SDS用量、处理时间和温度。4因素3水平L9（34）正交试验设计如表1所示。

1.4酶液的制备

取出鲤鱼肌肉组织一小块，用电子天平称重为3.553 g，加0.9% NaCl溶液5 mL，用研钵将肌肉研磨，直至得到鲤鱼肌肉酶液。用移液器将鲤鱼肌肉酶液转移到5 mL试管，以3 000 r/min离心15 min，吸取上清液，待测。

1.5LPO含量的测定

每测定管加入0.3 mL酶液、0.1 mL SDS、0.3 mL乙酸、0.2 mL 2%硫代巴比妥酸溶液。分别在18、65和95 ℃下反应，于20、35和60 min时取出相应测定管，加入1.0 mL 甲醇，充分混匀后离心，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，用分光光度计在波长535 nm处测其吸光度值。

2结果与分析

2.1正交试验结果的直观分析

鲤鱼肌肉中LPO含量测定的正交试验结果见表2。

对各因素的极差进行比较，可知RB>RA>RD>RC，得出各因素对测定结果的影响由大到小依次为SDS用量、乙酸用量、温度、处理时间。可以看出，SDS和乙酸的用量对LPO含量测定的影响占主要因素，反应温度和时间的影响次之。

通过每个试验因子的均值可以看出，A3B1C3D2为测定鲤鱼肌肉组织中LPO含量的最佳方案，即为正交试验中的7号处理组合，也是9个处理组合中吸光度值最高者，但与其他处理有无统计学差异，还需进行方差分析。

2.2正交试验结果的方差分析方差分析结果显示，FA=10.9，FB=23.3，FC=1.0，FD=5.6，F0.05=19.0，F0.01=99.0。可以看出，只有因素B的F值达到显著水平（P<0.05），即SDS的用量对LPO含量的影响最为显著，其他因素的影响均不显著。这与文献[5]报道的方法有所不同，主要区别在于SDS的含量，文献报道可加入5.0%的SDS，以除去蛋白质的干扰，而此次正交试验的结果显示，其对LPO含量的测定具有一定的干扰，SDS在不加入时效果最为明显，在加入2.5%和5.0%时达不到最佳测定条件，作用不但不明显，反而具有干扰作用，因此以不用为宜。

3结论

近年来，药物中间体、杀虫剂等环境污染物逐渐威胁水生生物安全，研究水体生物的氧化应激，可评价污染物的毒性，为疾病的早期诊断、预防和治疗提供科学依据。该研究通过设计4因素3水平的正交试验，确定了鱼体肌肉中LPO含量测定的最佳条件为20%的乙酸，反应时间60 min，反应温度65 ℃。该方法操作简单、快速、稳定，可较好地测定鱼体肌肉组织中LPO含量，为鱼类氧化应激评定提供了依据，有望用于毒性物质或未知物对鱼类造成的氧化应激损伤机理的研究。

参考文献

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