肝水解肽注射液中亚硫酸氢钠含量测定方法的研究

周月乔

【摘 要】目的：建立紫外-分光光度法测定肝水解肽注射液中亚硫酸氢钠的含量。方法：利用亚硫酸氢根与EDTA2-在酸性条件下，与甲醛和碱性品红作用，生成紫色复合物，在555nm处测定吸光度，以此计算亚硫酸氢钠含量。结果：亚硫酸氢钠浓度在0.2～8.0（*0.6391）μg·ml-1范围内与吸光度呈良好线性关系，其线性方程为A=0.507C+0.2745， r=0.9992。用厂家样品进行加样回收试验，回收率在98%以上，RSD小于0.7%（n=6）。结论：该方法稳定，简便易行，快速准确。

【关键词】分光光度法；亚硫酸氢钠；肝水解肽注射液

肝水解肽注射液是临床上广泛用于促进肝细胞增殖的药品，收集到的多家药品处方中显示添加了亚硫酸氢钠。亚硫酸氢钠是一种药用辅料[1]，常作为抗氧剂添加于各种药物制剂中以提高药品制剂的稳定性，然而临床上多有报道注射液中亚硫酸氢钠对患者肝功能有影响[2-3]，导致转氨酶升高，严重的可能引起肝细胞坏死。因此对亚硫酸氢钠在注射剂中加入量进行检测和控制，是加强药品质量监管，提高肝水解肽注射液用药安全的重要手段。为最大限度地控制肝水解肽注射液中亚硫酸氢钠的用量，减少不良反应，本文参考文献[4-5]建立了比色法测定肝水解肽注射液中亚硫酸氢钠的含量，利用亚硫酸氢根在EDTA2-存在的酸性条件下，与甲醛及碱性品红作用，生成紫色复合物，在反应完成后于560nm处测定反应液吸光度。根据标准品吸光度拟合的标准曲线计算测定肝水解肽注射液的亚硫酸氢钠含量。经试验，肝水解肽注射液中其他成分对亚硫酸氢钠测定无干扰，该方法简便易行，准确度、精密度均令人满意，可作为肝水解肽注射液质量控制的重要手段。

1 仪器与试药

CARY 100型分光光度计（瓦里安公司）：亚硫酸氢钠为分析纯，其亚硫酸氢钠含量经标定为63.91%；盐酸、甲醛、乙二胺四乙酸二钠为分析纯；碱性品红为分析纯；水为超纯水；肝水解肽注射液5个厂家样品共11个批次。

2 试验方法的研究和测定

2.1 测定波长的选择

精密称取亚硫酸氢钠适量，加0.01%EDTA-Na2溶液溶解并稀释成每1ml中约含亚硫酸氢钠2.58μg的溶液：精密量取该溶液10ml，0.05%碱性品红溶液1ml与0.2%甲醛溶液1ml，置25ml比色管内，盖上管塞，摇匀，室温放置20分钟，在200nm～800nm范围进行扫描，测得吸光度值在550～560nm范围内较好且较稳定，故选择555nm为测定波长。

2.2 本底干扰考察

按各厂家处方，配制扣除亚硫酸氢钠的肝水解肽本底溶液，照“测定波长选择”项下方法显色后于555nm测得吸光度，与相同显色方法的空白试液比较吸光度。结果表明，肝水解肽注射液中各主药及其它辅料对本试验测定结果无影响。

2.3 显色反应所用试剂浓度选择

2.3.1 亚硫酸氢钠对照液的制备

取亚硫酸氢钠适量，精密称定，加0.01%EDTA-Na2水溶液制成每1ml约含100μg的溶液，精密量取适量，用0.01%EDTA-Na2溶液稀释成浓度约为0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0（*0.6391）μg·ml-1的系列亚硫酸氢钠对照液。

2.3.2 碱性品红溶液制备

取碱性品红0.05g置100ml量瓶中，加盐酸5ml溶解，加水至刻度，摇匀。

1）碱性品红溶液浓度选择

在甲醛溶液浓度为0.2%的条件下，分别取0.01%与0.05%碱性品红水溶液别与系列亚硫酸氢钠对照液进行显色反应，将测得吸光度与浓度作线性关系考察，结果见表1与表2。结果表明，在0.05%碱性品红溶液条件下，亚硫酸氢钠对照液的线性关系优于0.01%碱性品红溶液，故碱性品红溶液浓度选择为0.05%。

表1 0.05%的碱性品红与0.2%的甲醛溶液的线性结果

表2 0.01%的碱性品红与0.2%的甲醛溶液的线性结果

2）盐酸加入量选择

取碱性品红0.05g三份，分别用盐酸2ml、5ml、8ml溶解，加水至刻度，摇匀。分别与亚硫酸氢钠浓度对照液（0.5μg·ml-1）进行显色反应，考察盐酸加入量与显色反应关系。结果表明，加入5ml或8ml的盐酸均可保证吸光度落在0.3～0.7的最佳定量范围内，但考虑到试验操作的简便性，最终盐酸加入量选择为5ml。

表3 不同体积盐酸加入量测得的吸光度

2.4 显色时间

精密量取0.5μg·ml-1的亚硫酸氢钠对照液10ml、0.05%碱性品红溶液1ml与0.2%甲醛溶液1ml，置于25ml比色管内，盖上管塞，摇匀，分别在室温下放置10、20、25、30、35、40、50分钟后测定显色液的吸光度。结果发现，反应后30分钟时显色液吸光度最大，与50min时的吸光度值接近无较大差别，为提高试验效率，将反应时间选择为30分钟。

2.5 线性试验

分别精密量取“2.3.1亚硫酸氢钠对照液的制备”项下系列浓度对照液10ml、0.05%碱性品红溶液与0.2%甲醛溶液各1ml，置25ml比色管内，盖上管塞，摇匀，室温下放置30分钟后于555nm测定吸光度，同时以空白试验进行校正，绘制标准曲线。结果表明，亚硫酸氢钠浓度在0.2～8.0（*0.6391）μg·ml-1范围内与吸光度呈良好线性关系，其线性方程为A=0.507×C+0.2745，r=0.999。考虑到本标准曲线方程所得截距对结果影响较大，而且作为抗氧剂亚硫酸氢钠在其出厂期与货价期随时间推移含量的波动较大，故含量测定选用了适用浓度范围较大，结果较为准确的标准曲线法进行。

2.6 回收率试验

精密量取厂家D注射液0.5ml，置100ml量瓶中，加0.01%EDTA-Na2溶液稀释至刻度，摇匀，为供试溶液A。精密称定亚硫酸氢钠0.4g稀释至0.4mg/ml（实际亚硫酸氢钠含量为0.25564mg/ml），精密量取厂家D注射液0.5ml与上述亚硫酸氢钠溶液1.0ml置100ml量瓶中，加0.01%EDTA-Na2溶液稀释至刻度，摇匀，为供试溶液B。照“线性试验”项下方法绘制标准曲线并分别测得两供试溶液的吸光度，平行测定6份，将结果代入标准曲线计算加样回收率。测得的回收率RSD为0.64%。说明该方法可靠。结果见表4：

表4 回收率实验结果

2.7 各厂家亚硫酸氢钠的含量测定

精密量取待测厂家肝水解肽注射液1ml，分别置25、50、100ml量瓶中，加0.01%EDTA-Na2溶液稀释至刻度，摇匀，照“线性试验”项下方法测定吸光度，绘制标准曲线，并将样品吸光度代入标准曲线计算亚硫酸氢钠含量。各厂家样品的测定结果见表5：

表5 不同厂家肝水解肽注射液中亚硫酸氢钠含量

3 讨论

1）本文用比色法测定肝水解肽注射液中亚硫酸氢钠的含量，经方法学验证，本方法可行，主药及其他辅料均无干扰。

2）试验中分别取0.1%、0.15%、0.2%的甲醛溶液，在碱性品红溶液浓度为0.05%的条件下，分别与系列亚硫酸氢钠对照液进行显色反应，结果表明甲醛溶液浓度变化对本反应影响较小可以忽略，考虑甲醛浓度越大显色反应越充分，故选择浓度为0.2%的甲醛溶液。

3）试验中还对显色时间进行了考察，结果表明温度对反应溶液的最大吸收波长并没有影响，但温度越高，反应速度快，吸光度不稳定；温度低，反应时间与灵敏度相应延长与降低，最后确定本反应的最适反应温度为20～25℃，对照管与样品管需在相同条件下显色，以保证结果的可靠性。

4）由检测结果可以看出，不同厂家肝水解肽注射液中亚硫酸氢钠的含量不同，含量差别较大。由于亚硫酸氢钠含量过大会对人体产生毒副作用，含量过低又不能起抗氧剂的作用，因此希望有关部门尽快制订出肝水解肽注射液中亚硫酸氢钠的质量标准，以规范各厂家的生产过程中的亚硫酸氢钠用量，保证广大患者的用药安全。

【参考文献】

[1]郑策，梅丹，王兰，李大魁，汤光.关注制剂中辅料的不良反应[J].中国药学杂志，2005，40（9）：644-649.

[2]陶国运，张国栋.肝乐宁注射液治疗肝炎肝硬化疗效观察[J].中国误诊学杂志，2008，8（1）：61-62.

[3]昌荣林.肝乐宁、肝细胞生长素与G-I治疗重型乙型肝炎的疗效比较[J].临床肝胆病杂志，2002，18（2）：122-123.

[4]张胜东.分光光度法测定盐酸多巴酚丁胺注射液中亚硫酸氢钠含量[J].中国医药科学，2011，1（17）；44-45，58.

[5]梁艳利，张慧丽，吴拥军.光度法测定依达拉奉注射液中抗氧剂焦亚硫酸钠的含量[J].河南科学，2010，28（11）：1403-1404.

[责任编辑：汤静]