UPLC法检测HNHHJ-1菌株发酵液中2-羟基联苯含量*

张 宇，张 玥，马 宁，王志成

（黑龙江省科学院 能源环境研究院，黑龙江 哈尔滨 150090）

UPLC法检测HNHHJ-1菌株发酵液中2-羟基联苯含量*

张 宇，张 玥，马 宁，王志成**

（黑龙江省科学院 能源环境研究院，黑龙江 哈尔滨 150090）

采用超高效液相色谱法(UPLC)测定脱硫菌发酵液中2-羟基联苯（2-HBP）的含量。色谱柱为ACQVITYDPLC@BEH C18（2.1×50mm,1.7μm,Waters），流动相为甲醇∶水（90∶10，V/V），柱温30℃，流速0.2mL/min，进样量2μL，PDA检测器检测2-HBP，检测器检出限范围为0～200mg/L。结果显示2-HBP的保留时间为0.74min。利用该检测方法得到HNHHJ-1菌株培养后的发酵液中2-HBP的含量为5.35mg/L。

超高效液相色谱法；2-HBP；检测

前言

2-羟基联苯（2-biphenylol，2-HBP），又名邻苯基苯酚、邻苯基酚、（1,1’-二苯基）-2-酚、苯基苯酚。可用作阻燃剂、表面活性剂、杀菌防腐剂，还可用于医药、印染助剂和染料中间体，在日本，2-HBP及其钠盐用于柑桔的防霉，而英国、美国和加拿大允许使用的水果范围较大，还包括苹果、梨和菠萝等[1～8]。另外，2-HBP还可以用于化妆品。美国环境保护局（EPA）允许使用以邻苯基苯酚或其钠盐为主要成分的杀菌皂、杀菌除臭洗剂、防腐保鲜剂。目前，该化合物的生产都采用真空蒸馏法，而分析羟基联苯类化合物通常需要繁琐的前处理步骤，目前大多数采用比色法、同步荧光法、高效液相色谱法等。其中高效液相色谱法是最常用的方法[1,2]。

1 材料和方法

1.1 菌种、培养基和试剂

菌种：具有降解二苯并噻吩（DBT）能力的菌株HNHHJ-1，分离自大庆油田井口附近含油土壤。

培养基：基础培养基由质量浓度为8.0g/L葡萄糖，2.5g/LNH4Cl，6.5g/LKH2PO4，8.5g/LK2HPO4，0.3g/L MgCl2·6H2O，分别加入1.0mL/L微量元素溶液母液和维生素溶液母液，pH值7.0～7.2。微量元素母液由质量浓度为 0.8g/L FeCl2·4H2O，0.8g/L ZnCl2，0.8g/L MnCl2·4H2O，0.2g/LNaMoO4·2H2O，0.08g/LCuCl2，0.08g/L NaWO4·2H2O和150mmol/LHCl组成。维生素母液由质量浓度500mg/L泛酸钙，300mg/L肌醇，500mg/L烟酸，500mg/L盐酸吡哆醇，300mg/L对氨基甲苯和0.8mg/L维生素B12组成[2]。

选择性培养基：将一定浓度的DBT加入到基础培养基中。

试剂：甲醇（HPLC），二苯并噻吩（DBT），葡萄糖，氯化铵，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，六水氯化镁，四水氯化亚铁，氯化锌，四水氯化锰，二水钼酸钠，氯化铜，二水钨酸钠，盐酸，泛酸钙，肌醇烟酸，盐酸吡哆醇，对氨基甲苯和维生素B12。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪（包括Waters 510泵，柱温箱，Waters PDA检测器和Waters EmpowerTM）美国Waters公司；色谱柱（ACQVITY DPLC@BEH C18，50×2.1mm，1.7μm）美国Waters公司；超声波清洗机。

1.3 方法

1.3.1 超高效液相色谱条件

PDA检测器，色谱柱为ACQVITY DPLC@BEH C18，柱温30℃，流动相为甲醇∶水（90∶10，V/V），使用超声脱气，各样品均用0.22μm滤膜过滤并经过脱气处理；流速0.2mL/min，进样量2μL。

1.3.2 待测样品提取

在含有100mL分离培养基的250mL三角瓶中接种HNHHJ-1菌株，初始pH值7.0～7.2，培养温度30℃、摇瓶转速100r/min培养3d，用循环水真空过滤器进行过滤，取200mL抽滤后的发酵液，加入等体积的正己烷，振荡2min，充分混匀萃取两次，合并正己烷，旋转蒸发除去正己烷，蒸发瓶内残留物用甲醇定容至10mL，用UPLC样品过滤专用滤膜过滤后，用超高效液相色谱分析。

1.3.3 标准溶液和曲线

二苯并噻吩（DBT）标准溶液：用分析天平称量0.04gDBT，溶于100mL甲醇中，制得质量浓度为400mg/L标准溶液;

2-羟基联苯（2-HBP）标准储备液：用分析天平称量0.1g 2-HBP，溶于100mL甲醇中，制得质量浓度为1000mg/L标准溶液。

2-HBP标准曲线：分别配制质量浓度为10、15、20、40、60、80mg/L的2-HBP标准溶液。利用UPLC进行分析测定，每次进样量为2μL，以2-HBP浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 精密度实验

用稀释20倍的2-HBP标准储备液和质量浓度为50mg/L的2-HBP标准溶液进行精密度实验。分别吸取各溶液3份，用UPLC法进行2-HBP含量测定，比较同一样品6次检测结果的差异。

1.3.5 回收率实验

分别将一定量的2-HBP对照溶液加入到已知浓度的2-HBP发酵液中进行回收率实验，每个浓度设2个平行，用UPLC法进行2-HBP含量测定，确定其回收率。

2 结果与讨论

2.1 2-HBP超高效液相色谱检测条件的确立

由于主要以发酵液中DBT的残留量和2-HBP的生成量为检测对象，故主要是以二者的分离情况作为是否能够进行检测的标准。检测结果显示，当流动相为甲醇∶水（10∶0，V/V）时（如图1a），保留时间间隔太短，虽然二者峰型较好，但是分离效果不是很好；当流动相为甲醇∶水（90∶10，V/V）时（如图1b），DBT和2-HBP分离效果明显，而且峰型也较好，当流动相为甲醇∶水（80∶20，V/V）时（如图1C），虽然DBT和2-HBP分离效果明显，但峰型不是特别好，故选择流动相的配比为甲醇∶水（90∶10，V/V）。

图1 甲醇与水体积比对DBT（400mg/L）和2-HBP（200mg/L）在UPLC色谱中分离的影响Fig.1 The influence of methanol/water volume ratio on UPLC separation of DBT（400 mg/L）and 2-HBP（200 mg/L）

2.2 2-HBP保留时间的确定

将经酸化及萃取处理后未接种的培养基，与200mg/L 2-HBP标准品混合进样，2-HBP的保留时间为0.73min（图2）。

图2 2-HBP（200mg/L）标准品UPLC色谱图Fig.2 The 2-HBP（200 mg/L）standard UPLC chromatogram

2.3 2-HBP标准曲线

分别在超高效液相色谱条件下对质量浓度为10、15、20、40、60、80mg/L的2-HBP标准溶液进样测定，各质量浓度均测定3次并取其平均值，以2-HBP质量浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明质量浓度在0～80mg/L范围内曲线线性良好。2-HBP的质量浓度和峰面积之间的相关方程为y=5427.2X-8406.5，R2=0.9997。

图3 2-HBP标准曲线Fig.3 The standard curve of 2-HBP

2.4 精密度和回收率

取3份50mg/L的2-HBP标准溶液用UPLC法进行测定，重复进样6次，峰面积相对标准偏差小于1.5%。分别加入一定量的2-HBP对照溶液到已知浓度的2-HBP发酵液中进行回收率实验，每个浓度设2个平行，具体加入量及结果见表1。2-HBP的平均回收率为97.73%，RSD为0.28%（n=6）。

表1 检测的2-HBP回收率（n=6）Table 1 The recovery rates of 2-HBP with different addition amounts（n=6）

2.5 HNHHJ-1降解DBT生成2-HBP测定

将HNHHJ-1以1%的接种量接入培养基中培养3d，取经处理后的培养液进行UPLC检测分析，发现HNHHJ-1将DBT降解为2-HBP，超高效液相色谱显示DBT及2-HBP保留时间分别为1.07min和0.74min,得到良好的分离（图4），与标准品保留时间相符、且峰型好。根据标准曲线和超高效液相峰面积（图4）计算得出，此时培养液中2-HBP含量为5.35mg/L。

图4 HNHHJ-1最佳培养条件下培养液UPLC色谱图Fig.4 The UPLC chromatogram of HNHHJ-1 broth under optimal culture conditions

3 结论

本研究得到的UPLC法检测2-HBP的色谱条件为：以ACQVITYDPLC@BEH C18为色谱柱，流动相为甲醇∶水（90∶10，V/V），流速0.2mL/min，进样量 2μL，PDA检测器。2-HBP的保留时间为0.74min，检出线性范围为范围为0～80mg/L。利用该方法测定的HNHHJ-1菌株发酵液中的2-HBP的含量为5.35mg/L。

［1］ 葛箐萍，王莉丽，平文祥.HPLC法测HDBRS-1菌株发酵液中2-羟基联苯含量［J］.食品科学，2009,30（22）：290～292.

［2］ 宋静.二苯并噻吩脱硫菌的筛选及其代谢途径研究［D］.武汉：华中科技大学，2011.

［3］ 马挺，佟明友，张全，等.脱硫菌Fds-1的分离鉴定及其对柴油脱硫特性的研究［J］.微生物学报，2006,46（1）：104～110.

［4］ 张建斌，于熙昌，魏雄辉，等.Mycobacterium.sp BY11脱硫代谢产物的色谱分析［J］.内蒙古工业大学学报，2010，29（4）：260～264.

［5］ 李凌凌，吕早生，吴敏，等.二苯并噻吩降解菌的筛选鉴定及煤脱硫的研究［J］.环境工程学报，2010，4（10）：2391～2396.

［6］ 詹晓，冯守帅，张玲，等.一株CX-DBT脱硫菌的筛选及发酵条件优化［J］.微生物学通报，2016,43（6）：1171～1180.

［6］ 万涛.戈登氏菌Gordonia sp.WQ-01对石油中二苯并噻吩（DBT）生物脱硫的研究［D］.天津：天津大学，2011.

［7］ 明龙.二苯并噻吩脱硫菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究［D］.长春：吉林农业大学，2015.

［8］ 高超，吴涓，李玉成，等.一株生物脱硫菌株的分离、鉴定及其脱硫活性的研究［J］.生物学杂志，2010，27（4）：39～41，34.

Determination of 2-Hydroxybiphenyl Content in Fermentation Broth of Desulfurization Strain HNHHJ-1 by UPLC Method

ZHANG Yu,ZHANG Yue,MA Ning and WANG Zhi-cheng
（Institute of Energy&Environmental Research Heilongjiang Academy of Science,Harbin 150090,China）

The concentration of 2-hydroxybiphenyl（2-HBP）in the fermentation broth of desulfurization strain was determined byultra performance liquid chromatography（UPLC）.The 2-HBP was separated by a chromatographic column（2.1×50 mm,1.7μm,waters）,eluted with methyl alcohol and water with a volume ratio of 90∶10 at a flow rate of 0.2mL/min and detected with PDA detector;the column temperature was 30℃,and the sample quantity was 2μL.The results showed that the retention time of 2-HBP was 0.74min with a detection limit of 0～200mg/L.The 2-HBP concentration in the fermentation broth of strain HNHHJ-1 was 5.35mg/L.

UPLC;2-HBP；detection

O657.72

A

1001-0017（2017)01-0040-03

2016-10-09

黑龙江省青年科学基金（编号：QC2014C028）

张宇(1983－)，男，黑龙江肇州人，助理研究员，研究领域为环境与节能技术。

**通讯联系人：王志成（1973-），男，黑龙江哈尔滨人，研究员级高级工程师，从事生物质能源、替代能源和室内环境研究。