长链非编码核糖核酸牛磺酸上调基因1在肺腺癌中的表达及生物学意义研究*

韩鹦赢，沈鹏

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津市第一中心医院 免疫科，天津 300192）

长链非编码核糖核酸牛磺酸上调基因1在肺腺癌中的表达及生物学意义研究*

韩鹦赢1，沈鹏2

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津市第一中心医院 免疫科，天津 300192）

目的 探讨长链非编码核醣核酸牛磺酸上调基因1（lncRNA-TUG1）在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌A549细胞生长的影响。方法选取2012年1月-2014年12月间于天津市第一中心医院胸外科行手术切除的肺腺癌患者的肿瘤组织及对应癌旁组织40例。运用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术检测lncRNA-TUG1在组织中的表达水平，分析lncRNA-TUG1表达与患者临床病例资料间的相关性；通过siRNA沉默人肺腺癌A549细胞中lncRNA-TUG1的表达，采用噻唑蓝实验检测沉默lncRNA-TUG1后A549细胞增殖变化，流式细胞仪检测细胞凋亡变化，qRT-PCR及W estern blot检测P16表达变化。结果lncRNA-TUG1在肺癌组织中表达水平高于对应癌旁组织（t=3.873，P=0.000），肺癌组织中lncRNA-TUG1高表达与肿瘤直径增大（P=0.033）及高TNM分期（P=0.045）相关；lncRNA-TUG1特异性siRNA转染A549细胞后可抑制细胞增殖（P=0.041）并上调凋亡细胞比例（t=3.206，P=0.007）；qRT-PCR及W estern blot结果证实，沉默lncRNA-TUG1后可促进P16 mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）。结论lncRNA-TUG1在肺腺癌组织中表达上调并与肿瘤恶性临床病理特征有关，lncRNA-TUG1可能通过下调抑癌基因P16的表达来促进肺腺癌生长。

lncRNA-TUG1；肺腺癌；增殖；凋亡；P16

肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤[1]，由于其早期症状隐匿，手术后易复发且放化疗敏感性低等生物学特点，肺癌已成为危害我国人民群众身体健康的重大公共卫生问题[2]。肺癌病理类型复杂，其中肺腺癌是女性和非吸烟者较为常见且恶性程度较高的病理类型之一[3]，对肺腺癌细胞生物学特性的研究对于寻找新的治疗靶点及提高我国肺癌诊治水平具有重要意义。

长链非编码核糖核酸（long noncoding ribonucleic acid，lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的非编码单链RNA[4]，在肿瘤生长、转移等生物学过程中发挥重要调节作用[5]。最新研究指出，长链非编码核糖核酸牛磺酸上调基因1（long noncoding ribonucleic acid taurine up-regulated gene 1，lncRNA-TUG1）在癌症进展过程中具有重要的调节作用[6]，例如在结肠癌中，低表达的lncRNA-TUG预示着患者有较差的预后，并且对结肠癌细胞的侵袭具有抑制作用[7]。而通过文献检索笔者发现，其在肺腺癌中的临床意义及生物学功能尚不清楚。本研究通过检测lncRNA-TUG1的表达及对肺腺癌A549细胞增殖、凋亡过程的调控作用，研究lncRNA-TUG1在肺癌生长中的临床意义及作用机制，为肺癌的分子诊断与靶向治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床标本及主要试剂

选取2012年1月-2015年12月于天津市第一中心医院行手术切除并经病理检查证实为肺腺癌患者的肿瘤组织及对应癌旁组织（距肿瘤边缘＞2 cm）40例。其中女性27例，男性13例；平均年龄（53.2±2.1）岁。RNA提取试剂盒fast 200购自上海飞捷生物科技有限公司。lncRNA-TUG1 siRNA及阴性对照siRNA，lncRNA-TUG1引物（正向引物5'-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3'，反向引物5'-TAG CAGTTCCCCAATCCTTG-3'），P16引物（正向引物5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3'，反向引物5'-CCACCTAAATCAACCTCCAACCA-3'），β-actin引物（正向引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'）均购自上海吉玛生物科技有限公司。噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]试剂盒及Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自上海生工生物科技有限公司，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR） 试剂盒[Prime ScriptTMRT reagentKi（tPerfect Real Time）]及实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒[SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）]均购自大连宝生物工程有限公司，兔抗人P16多克隆抗体及鼠抗人β-actin单克隆抗体购自美国CST公司。肺癌A549细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。

1.2 RNA提取及qRT-PCR检测

按fast 200说明书分别提取组织及A549细胞中总RNA，经紫外分光光度计检测，光密度（optical delnsity，OD）260/OD280在1.9～2.1者为合格样品。取500ng总RNA为模板，按RT-PCR试剂盒说明书配制逆转录反应体系，采用Random 6及Oligo-dT双引物法逆转录细胞内lncRNA及mRNA。逆转录完成后，以 2μl cDNA配制 qRT-PCR体系，按qRT-PCR说明书要求扩增靶基因。

1.3 细胞转染

A549细胞接种于6孔板中，接种密度以过夜培养后融合度可达50%为准。依据2000说明书，以无血清改良伊格尔培养基做溶媒配制转染试剂及siRNA工作液，分别向A549细胞中转染lncRNA-TUG1 siRNA（lncRNA-TUG1组）及阴性对照siRNA（NC组）。转染6 h后更换为含10%胎牛血清的完全培养基。

1.4 MTT检测

分别收集转染24、48及72 h后的A549细胞，重悬后以2 000/孔接种于96孔板中，调整细胞悬液体积为100μl/孔，培养至细胞贴壁。每孔加入10μl MTT试剂继续培养4 h，弃去上清液后加入二甲基亚砜溶液溶解甲瓒结晶，15min内用酶标仪检测490nm波长下的OD值。

1.5 细胞凋亡检测

A549细胞转染72 h后使用PBS溶液洗涤细胞2次，按试剂盒说明书要求，采用Binding buffer（1×）重悬细胞并调整细胞密度至2×105/ml，于检测管中加入195μl细胞悬液后加入5μl Annexin V-FITC，避光孵育15min后，使用200μl Binding buffer（1×）洗涤细胞并以1000 r/min离心细胞3min，再次以190μl Binding buffer（1×）溶液重悬细胞后加入10μl Propidium Iodide，避光孵育15min后于流式细胞仪上进行检测。

1.6 Western blot检测

收集转染72 h的A549细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞，聚氰基丙烯酸正丁酯法测定总蛋白浓度。每孔上样50μg蛋白后以BIO-RAD垂直电泳系统分离目的蛋白，以1∶1 000稀释的P16及β-actin一抗结合相应目的蛋白，以1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗结合一抗，增强化学发光法发光检测蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验或ANOVA检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA-TUG1在肺癌及癌旁组织中的表达

经PCR定量检测发现，肺腺癌组织中lncRNATUG1的相对表达量（6.236±0.331）与对应癌旁组织（2.344±0.107）比较，差异有统计学意义（t=3.873，P=0.000）。肿瘤直径及TNM分期不同，肺腺癌组织中lncRNA-TUG1的表达水平比较，差异有统计学意义，其中，肿瘤直径增大（≥5 cm，P=0.034），高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期，P=0.041）者lncRNA-TUG1的表达水平较高。见附表。

2.2 沉默lncRNA-TUG1对A549细胞增殖凋亡功能的影响

通过qRT-PCR检测证实，lncRNA-TUG1特异性siRNA能明显沉默细胞内lncRNA-TUG1的表达水平，（1.000±0.000）vs（0.337±0.021）（t=23.466，P=0.000）。见图1A。

成功沉默A549细胞内lncRNA-TUG1表达后，采用MTT法检测lncRNA-TUG11表达水平变化对A549细胞增殖能力的影响。与NC组比较，沉默lncRNA-TUG1后A549细胞的增殖活力下降（P=0.039）。对转染72 h后的肿瘤细胞进行Annexin V-FITC和PI染色，通过流式细胞仪分析染色结果发现沉默lncRNA-TUG1对A549细胞的凋亡具有促进作用，（19.295±1.077）vs（9.383±1.014），（t=4.406，P=0.038）。见图1B～D。

2.3 沉默lncRNA-TUG1对A549细胞中P16表达的影响

P16是一种能通过与细胞周期蛋白-CDK复合物结合来抑制细胞周期进展的抑癌蛋白。在A549细胞内沉默lncRNA-TUG1表达后，通过qRT-PCR和 Western blot检测表明，P16 mRNA[（1.000±0.000）vs（3.471±0.109），t=25.796，P=0.000]及蛋白[（0.386±0.050）vs（0.882±0.107），t=26.038，P=0.000]水平均较NC组升高，提示lncRNA-TUG1可能是通过抑制P16表达实现促肿瘤细胞生长作用的。见图2A、B。

附表 lncRNA-TUG1表达与肺癌患者临床病理特征的关系 （n=40，±s）

附表 lncRNA-TUG1表达与肺癌患者临床病理特征的关系 （n=40，±s）

项目lncRNA-TUG1相对表达量P值年龄＜50岁6.719±0.211≥50岁 5.528±0.112 0.677吸烟与否吸烟6.193±0.121不吸烟 6.348±0.214肿瘤直径＜5 cm 4.853±0.237≥5 cm 6.894±0.214组织学分级G1～G26.089±0.107 G3 6.313±0.132淋巴结转移无5.743±0.027有6.488±0.051 TNM分期无4.517±0.028有6.383±0.201 0.780 0.034 0.743 0.087 0.041

图1 沉默lncRNA-TUG1对A549细胞增殖凋亡的影响

图2 沉默lncRNA-TUG1对A549细胞P16表达的影响

3 讨论

在我国，肺癌长期占据恶性肿瘤发病率的首位[8]。随着分子生物学技术的进步，生物靶向治疗已成为肺癌重要的辅助治疗手段，针对表皮生长因子受体的易瑞沙、特罗凯及凯美纳的分子靶向药物已在肺癌治疗上获得巨大成功[9-11]。因而，寻找和研究有效的肺癌分子治疗靶点对改善广大肺癌患者预后具有重要意义。

越来越多的证据显示，包括mRNA及lncRNA在内的多种非编码RNA对细胞的生理及病理过程具有重要影响。lncRNA-TUG1在组织发育和疾病的发生过程中均具有重要作用，例如神经生物学证据表明，在小鼠大脑皮层发育的多个关键时期均能够检测到lncRNA-TUG1表达的显著上调[12]，而内分泌学研究结果则表明，沉默lncRNA-TUG1的表达会促进胰腺β细胞的凋亡和胰岛素分泌[13]。ZHANG等[14]的研究表明，lncRNA-TUG1在骨肉瘤组织中的表达上调与肿瘤体积增大、术后化疗抵抗及高Enneking分期相关，生存分析曲线结果也证实高表达的lncRNA-TUG1预示着较短的术后无瘤生存时间和总生存时间，上述结果表明lncRNA-TUG1对于肿瘤患者有一定的临床治疗效果监测和预后判断价值。

通过对临床组织标本中lncRNA-TUG1的表达检测证实lncRNA-TUG1高表达于肺腺癌组织当中。以患者不同临床病理特征为亚组的分析表明，lncRNA-TUG1高表达与肺癌患者肿瘤直径增大及高TNM分期密切相关。与其在骨肉瘤、膀胱癌[15]及脑胶质瘤[16]中的报道结果相一致。为进一步探讨lncRNA-TUG1在肺腺癌细胞中的生物学功能，笔者应用siRNA特异性敲低肺腺癌A549细胞中lncRNA-TUG1表达，通过MTT实验及流式细胞仪分析证实沉默lncRNA-TUG1对细胞增殖和凋亡均有影响。

P16又名MTS1，是细胞周期调控中的基本基因之一，能够与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4结合，负调节细胞增殖及分裂。超过50%的人类肿瘤细胞株中存在P16的纯合子缺失或者突变。因而，有学者认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因[17]。研究表明[18]，多梳蛋白抑制复合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）能通过对P16启动子H3K27位点进行甲基化修饰而抑制P16的表达。而肝细胞癌中的lncRNA-TUG1能够通过与PRC2复合物中EZH2和SUZ12 2种组分的结合而将PRC2募集至抑癌因子KLF2的启动子区域，进而促进HCC的生长和转移[19]。综合上述文献报道结果，笔者分析lncRNA-TUG1的促肺癌细胞生长作用可能是在表观遗传学层面通过启动子区域甲基化修饰作用而抑制P16的表达来实现。为证实该假说，笔者通过siRNA转染技术，特异性敲低A549细胞内lncRNA-TUG1的表达，通过qRT-PCR检测及Western blot检测发现，沉默lncRNA-TUG1可提高A549细胞内P16的表达水平，初步探明lncRNA-TUG1的作用机制。

综上所述，lncRNA-TUG1在肺腺癌组织中表达升高。lncRNA-TUG1可能通过表观遗传学机制下调P16的表达来抑制肺癌细胞的生长。因此，lncRNA-TUG1在肺癌生物靶向治疗中具有一定的研发价值。

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（张蕾 编辑）

Expression of long noncoding RNA TUG1 and its role in proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma*

Ying-ying Han1,Peng Shen2
(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Departmentof Immunology,Tianjin First Central Hospital,Tianjin 300192,China)

ObjectiveTo study the expression of long noncoding RNA TUG1(lncRNA-TUG1)in lung adenocarcinoma and its role in regulation of proliferation and apoptosis of A549 cells.MethodsThe lung adenocarcinoma tissues and matched paracancerous tissueswere collected from 40 patientswho had surgical resection between January 2012 and December 2014.The expression oflncRNA-TUG1was detected by qRT-PCR.lncRNA-TUG1specific siRNA was transfected into A549 cells.MTT assay and flow cytometer(FCM)were used to measure cell proliferation and apoptosis,respectively.The expression of P16 was detected by qRT-PCR and Western blot.ResultsThe expression oflncRNA-TUG1was significantly higher in the lung adenocarcinoma tissues than in the paracancerous tissues(t=3.873,P＜0.001).High expression oflncRNA-TUG1was positively associated with large tumor diameter(t=4.273,P=0.033)and advanced TNM stage(t=4.273,P=0.045).Knockdown oflncRNA-TUG1significantly suppressed cell proliferation and induced apoptosis in the A549 cells(P＜0.05).Moreover,the expressions of P16 mRNA andprotein were upregulated whenlncRNA-TUG1was silenced(P＜0.001).ConclusionsLncRNA-TUG1is overexpressed in lung adenocarcinoma tissues and associated with cell growth.LncRNA-TUG1may promote the progression of lung adenocarcinoma by inhibiting P16 expression.

lncRNA-TUG1;lung adenocarcinoma;proliferation;apoptosis;P16

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.009

1005-8982（2017）07-0041-05

2016-08-07

天津市卫生局中医处课题基金项目（No：2015047）