内脂素对2型糖尿病kkay小鼠骨骼肌组织PI3K和GLUT-4的影响*

王倩，阳琰，陈其荣，张晗，高琳，廖鑫，王茜

（遵义医学院附属医院 内分泌科，贵州 遵义 563003）

内脂素对2型糖尿病kkay小鼠骨骼肌组织PI3K和GLUT-4的影响*

王倩，阳琰，陈其荣，张晗，高琳，廖鑫，王茜

（遵义医学院附属医院 内分泌科，贵州 遵义 563003）

目的 观察内脂素（visfatin）对kkay糖尿病小鼠骨骼肌组织磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和葡萄糖转运蛋白4（GLUT-4）的影响。方法C57BL/6J小鼠随机分为普通饲料喂养组（CON）、高脂饲料喂养组（HFD），kkay小鼠随机分为糖尿病模型组（DM）和visfatin治疗组（V）。采用实时荧光定量PCR和W estern blot方法测定各组小鼠骨骼肌中PI3K和GLUT-4的mRNA和蛋白表达。结果V组腹腔注射visfatin后的血糖较注射前下降（P=0.013），差异有统计学意义。DM组PI3K、GLUT-4的mRNA及蛋白表达量较CON组、HFD组降低（P＜0.05），差异有统计学意义；V组PI3K、GLUT-4的mRNA及蛋白表达量较DM组增加（P＜0.05），差异有统计学意义。结论内脂素可上调骨骼肌组织PI3K和GLUT-4的表达。

内脂素；kkay小鼠；骨骼肌；PI3K；GLUT-4

糖尿病是以高血糖为特征的一组疾病，主要病理生理机制为胰岛素抵抗和（或）胰岛素分泌不足，其中2型糖尿病的主要病理机制是胰岛素抵抗。内脂素（visfatin）具有模拟胰岛素降糖作用，可改善胰岛素抵抗，但其降血糖的机制并不明确，部分研究结果并不一致。正常生理状态下，骨骼肌作为胰岛素作用的主要靶器官之一，葡萄糖在骨骼肌中的转运受损是导致外周胰岛素抵抗的重要原因。本实验选用自发型2型糖尿病动物模型kkay小鼠为研究对象，通过观察visfatin对kkay糖尿病小鼠骨骼肌组织磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase isoforms，PI3K）和葡萄糖转运蛋白4（glucose transport protein-4，GLUT-4）的影响，以期为糖尿病发病机制及治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物：SPF级8周龄雄性kkay小鼠，体重30 g左右，SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重20 g左右，均由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，许可证编号：SCXK（京）2009-0004；kkay小鼠全价高脂饲料（购自中国医科院实验动物研究所，组成：78.8%基础饲料，10%蛋黄粉，10%猪油，1%胆固醇，0.2%胆盐）；饲养于室温20～24℃，湿度40%～60%的环境中。实验材料：小鼠胰岛素测定试剂盒（美国R&D system公司），强生稳步倍加型血糖仪（测定血糖），内脂素重组蛋白购于以色列PROSPEC公司，GLUT-4抗体购于美国Abcam公司，PI3K抗体购于美国Cell signaling公司，逆转录试剂盒和PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，CFX Connect实时荧光定量PCR（RT-PCR）仪为美国Bio-Rad公司。

1.2 模型的复制及分组

C57BL/6J小鼠用随机数字法分为普通饲料喂养组（normal diet group，CON）和高脂饲料喂养组（high-fat diet group，HFD），kkay小鼠以高脂饲料喂养，每周定时测定1次空腹血糖，直至连续2次空腹血糖≥13.9mmol/L为糖尿病成模，成模后的小鼠继续喂养21周后又随机分为糖尿病模型组（diabeitc group，DM） 和 visfatin治疗组（visfatin treatment group，V），V组连续3 d腹腔注射visfatin重组蛋白（6μg/kg，0.05ml/10g）。DM组、CON组及HFD组均注射等量磷酸盐缓冲液（PBS）。

1.3 标本采集

腹腔注射麻醉（10%水合氯醛）小鼠成功后眼球取血，3 000 r/min离心15min取上清液保存于-80℃冰箱用于测定胰岛素。迅速分离小鼠右后侧骨骼肌组织，生理盐水清洗干净后滤纸吸干水分，取约100mg置于1ml Trizol中-80℃冰箱冻存，用于RT-PCR；其余骨骼肌速冻后置入-80℃冰箱冷冻保存用于Western blot检测。

1.4 RT-PCR法测定骨骼肌组织中PI3K、GLUT-4 m RNA的表达

按照氯仿-异丙醇-乙醇法提取骨骼肌总RNA，按TaKaRa逆转录试剂盒说明书进行逆转录。采用10μl PCR反应体系（正反向引物0.5μl+cDNA稀释液2μl+0.1% DEPC水 2.5μl+SYBR Green Su permix荧光混合物5μl）；反应条件：95.0℃×3min；95.0℃×10 s，60.0℃×45 s，共40个循环。每个样本均设副孔，取CT平均值。β-actin：正向引物5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，反向引物5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'；PI3K正向引物5'-CCCATGGGACAACATTCCAA-3'，反向引物5'-CATGGCGACAAGCTCGGTA-3'；GLUT-4正向引物5'-TTCTTATTGCAGCGCCTGAGTC-3'，反向引物5'-CCAAGCACAGCTGAGAATACAGCTA-3'。

1.5 Western blot法测定骨骼肌组织PI3K和GLUT-4蛋白的表达

取小鼠骨骼肌组织约100mg于1.5ml EP管中，剪刀将组织块剪碎后，加入1 ml裂解液 ，在冰上匀浆至乳糜状，离心20 min，取上清即为蛋白液，将蛋白液分装于小EP管中置入-80℃冰箱保存。按BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性（100℃，5min）后上样电泳，电转，封闭，加入PI3K、GLUT-4一抗孵育过夜。第2天洗膜后加入二抗摇床中孵育1 h，曝光。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，单因素方差分析用于多组间数据的比较，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠部分代谢指标

DM组体重较CON组升高（P=0.002），较HFD组升高（P=0.002），差异均有统计学意义；DM组血糖较CON组升高（P=0.010），较HFD组升高（P=0.007），差异均有统计学意义；V组血糖较DM组降低（P=0.027），差异有统计学意义。见表1。

2.2 小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 mRNA表达

DM组小鼠骨骼肌PI3K mRNA较CON组下降（P=0.043），较HFD组下降（P=0.045），差异均有统计学意义；V组小鼠骨骼肌PI3K mRNA较DM组上升（P=0.009），差异有统计学意义；DM组小鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA表达较CON组下降（P=0.014），较HFD组下降（P=0.012），差异均有统计学意义；V组GLUT-4 mRNA表达较DM组上升（P=0.004），差异有统计学意义。见表2。

表1 4组小鼠部分代谢指标比较 （n=8，±s）

表1 4组小鼠部分代谢指标比较 （n=8，±s）

注：1）与CON组比较，P＜0.05；2）与HFD组比较，P＜0.05；3）与DM组比较，P＜0.05；4）与注射visfatin（或PBS）前比较，P＜0.05

空腹胰岛素/（μIU/L）CON组 24.4±0.80 7.78±1.15 9.33±2.39 5.18±0.59 HFD组 25.04±1.03 9.04±1.25 9.64±1.03 6.55±0.401）DM组 41.23±3.951）2） 21.18±4.93 20.86±3.621）2） 8.63±0.671）2）V组 38.73±4.59 19.90±2.403） 13.43±1.103）4） 7.71±1.28F值 32.88 24.16 21.81 17.39P值 0.25 0.14 0.11 0.16组别 体重/g 血糖（给visfatin或PBS前）/（mmol/L） 血糖（给visfatin或PBS后）/（mmol/L）

表2 4组小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 m RNA表达比较（n=8±s）

表2 4组小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4 m RNA表达比较（n=8±s）

注：1）与CON组比较，P＜0.05；2）与HFD组比较，P＜0.05；3）与DM组比较，P＜0.05

GLUT-4/β-actin CON组 4.36±0.65 6.24±0.61 HFD组 3.94±0.29 6.16±0.64 DM组 3.41±0.181）2） 3.78±0.661）2）V组 4.23±0.253） 6.92±0.633）F值 4.77 18.60P值 0.27 0.90组别PI3K/β-actin

2.3 小鼠骨骼肌PI3K、GLUT-4蛋白表达

图1 4组小鼠骨骼肌组织PI3K蛋白的表达

如图1、2所示，DM组小鼠骨骼肌组织PI3K蛋白表达较CON组降低（P=0.007），差异有统计学意义；V组PI3K蛋白较DM组增高（P=0.013），差异有统计学意义；DM组GLUT-4蛋白表达量较CON组降低（P=0.004），较HFD组降低（P=0.009），差异均有统计学意义；V组GLUT-4蛋白表达量较DM组增高（P=0.004），差异有统计学意义。

图2 4组小鼠骨骼肌组织GLUT-4蛋白的表达

3 讨论

Visfatin自被发现以来，大量的研究致力于vis fatin与糖尿病的关系及其调控血糖的机制，该研究有望为糖尿病的治疗提供新的策略。研究发现，与健康人群相比，糖尿病人群血浆中的visfatin浓度均明显升高[1-4]。大量研究发现，visfatin浓度的升高也能使血浆葡萄糖水平呈剂量依赖性的降低[1-2，5-6]。该研究均表明Visfatin与血糖有着密切的关系。Visfatin主要在脂肪组织中表达，在肌肉、肝脏、活化的淋巴细胞、下丘脑等也有表达[7]。KRZYSIK-WALKER等发现，骨骼肌是小鸡体内visfatin的主要来源，visfatin可能影响骨骼肌的生长和代谢[8]。研究发现，在糖尿病的发生、发展过程中，骨骼肌的代谢障碍起着重要的作用[9]。因此，研究visfatin在骨骼肌中的代谢可能成为缓解胰岛素抵抗的突破点。Visfatin有多种生理功能[10]，有研究表明，visfatin有类胰岛素样作用，通过与胰岛素受体结合促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，抑制肝细胞葡萄糖的释放，从而达到降低血糖的作用[7，11]。研究表明，visfatin与胰岛素受体结合导致受体磷酸化、反向信号分子活化，visfatin与胰岛素非竞争性的与胰岛素受体结合，表明visfatin和胰岛素分别结合在胰岛素受体的不同部位[12]。

本实验发现，腹腔注射小鼠visfatin重组蛋白3 d后，血糖较注射visfatin前降低，表明visfatin降低血糖，可能visfatin与胰岛素降糖机制有所不同，值得笔者深入研究。本研究中HFD组空腹胰岛素较CON组升高，说明高脂饮食刺激，HFD组分泌较多的胰岛素，HFD组空腹胰岛素代偿性分泌增多的结果，使得HFD组小鼠的血糖维持动态平衡。与CON组、HFD组比较，DM组血糖及空腹胰岛素升高，同时DM组小鼠PI3K、GLUT-4 mRNA及蛋白表达均降低；糖尿病小鼠注射visfatin之后血糖下降，而空腹胰岛素反而下降，考虑visfatin降低血糖的机制并非是直接由胰岛素所起作用，可能visfatin具有类胰岛素作用。笔者前期研究也发现，visfatin在骨骼肌中的表达水平与骨骼肌糖脂代谢状态有关，visfatin可能通过PI3K信号传导通路参与骨骼肌糖脂代谢的调节。因葡萄糖的转运依赖GLUT-4在膜内外的转移，而GLUT-4的表达受其正向基因PI3K的调控。综合DM组和V组的上述实验结果，笔者推测visfatin可能是通过增加PI3K和GLUT-4的基因表达而起到降低血糖水平、改善胰岛素抵抗的作用。

总之，visfatin可上调 kkay小鼠骨骼肌组织PI3K、GLUT-4 mRNA及蛋白表达，从而影响血糖代谢。本研究有望为visfatin与糖尿病关系提供理论证据，而visfatin在糖脂代谢中的具体机制尚需在细胞水平及人体临床研究中进一步阐明。

[1]LAYLA K A.Visfatin levels in iraqi controlled diabetic patients and uncontrolled diabetic with cardiomyopathy[J].Journal of Natural Sciences Research,2015,5:39-41.

[2]ESTEGHAMATI A,ALAMDARI A,ZANDIEH A,et al.Serum visfatin is associated with type 2 diabetes mellitus independent of insulin resistance and obesity[J].Diabetes Res Clin PR,2011,91: 154-158.

[3]JEANNETTE M,MOLLY H,CYNTHIA SC,et al.Adipokine gene expression in peripheral blood of adult and juvenile dermatomyositis patients and their relation to clinical parameters and disease activity measures[J].J Neuroinflamm,2015,12:29.

[4]杨再刚,赵艳艳,岳欣阁,等.糖尿病患者血浆visfatin水平变化及意义[J].山东医药,2013,53(31):31-32.

[5]HAIDER D G,SCHALLER G,KAPIOTIS S,et al.The release of the adipocytokine visfatin is regulated by glucose and insulin[J]. Diabetologia,2008,49:1909-1914.

[6]CHEN M P,CHUNG FM,CHANG DM,et al.Elevated plasma level of visfatin/pre-B cell colony-enhancing factor in patients with type 2 diabetes mellitus[J].J Clin Endocrinol Metab,2006, 91(1):295-299.

[7]FUKUHARA A,MATSUDA M,NISHIZAWA M,et al.Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J].Science,2005,307:426-430.

[8]KRZYSIK-WALKER S M,OCN-GROVE O M,MADDINENI S R,et al.Is visfatin an adipokine or myokine?Evidence for greater visfatin expression in skeletal muscle than visceral fat in chickens[J].Endocrinology,2008,149(4):1543-1550.

[9]DEFRONZO R A,TRIPATHY D.Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes[J].Diabetes Care, 2009,32(2):S157-163.

[10]PRAGUE M R,SMITKA K,MARES OVÁD.Adipose tissue as an endocrine organ:an update on pro-inflmmatory and anti-inflmmatory microenvironment[J].Prague Medical Report,2015, 116(2):87-111.

[11]SESHI JK,VIDAL-PUIG A.visfatin:the missing link between intra-abdominal obesity and diabetes[J]Trends Mol Med,2005, 11:344-347.

[12]ADEGHATEE.Visfatin:structure,function and relation to diabetes mellitus and other dysfunctions[J].Curr Med Chem,2008, 15:1851-1862.

（张蕾 编辑）

Influence of visfatin on PI3K and GLUT-4 in skeletalmuscle of diabetic kkay m ice*

Qian Wang,Yan Yang,Qi-rong Chen,Han Zhang,Lin Gao,Xin Liao,Qian Wang
(Department of Endocrinology,the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College, Zunyi,Guizhou 563003,China)

ObjectiveTo observe the influence of visfatin on glucose transporter 4(GLUT-4)and phosphatidylinositol 3-kinase isoform(PI3K)in skeletal muscle of kkay mice.MethodsC57BL/6Jmice were random ly divided into normal diet group (group CON)and high-fat diet group (group HFD);kkay mice were divided into diabetic group (group DM)and visfatin treatmentgroup(group V).PI3K and GLUT-4mRNA and protein expressions in the skeletal muscle were measured by qRT-PCR and Western blot.ResultsIn the group V,blood glucose significantly decreased after intraperitoneal injection of visfatin(P=0.013).PI3K and GLUT-4mRNA and protein expressions of skeletalmuscle were significantly lower in the group DM than in the groups CON and HFD (P＜0.05).PI3K and GLUT-4 mRNA and protein expressions of skeletal muscle were significantly higher in the group V than in the group DM(P＜0.05).ConclusionsVisfatin increases the expressions of PI3K and GLUT-4 in skeletalmuscle.

visfatin;kkaymice;skeletalmuscle;PI3K;GLUT-4

R 589.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.001

1005-8982（2017）07-0001-04

2016-07-20

国家自然科学基金（No：81660142）

高琳，E-mail：lgzymc@sina.com，Tel：13595286671