槲寄生滴眼液预防去势雄兔干眼症的实验研究*

叶蕾，叶鳞泓，张颖，魏荣，姜楠，裴重刚，高桂平，邵毅

（南昌大学第一附属医院 眼科，江西 南昌 330006）

槲寄生滴眼液预防去势雄兔干眼症的实验研究*

叶蕾，叶鳞泓，张颖，魏荣，姜楠，裴重刚，高桂平，邵毅

（南昌大学第一附属医院 眼科，江西 南昌 330006）

目的 探究槲寄生滴眼液对预防去势雄兔干眼症的效果。方法取健康雄兔36只，将24只雄兔行双侧睾丸切除术制作去势雄兔模型随机分成两组。A组为槲寄生滴眼液组，B组为生理盐水组，剩下的12只为C组仅切开阴囊，不切除睾丸。分别于治疗前、治疗后2、4和8周检查两组泪液分泌实验、角膜荧光素染色、泪液蛋白以及角膜共焦显微镜下的情况。结果治疗2、4和8周后，A组泪液分泌实验（SIT）和角膜荧光素染色（FL）较治疗前稍有改变，但差异无统计学意义（P＞0.05），而B组SIT和FL较处理前恶化，差异均有统计学意义（P＜0.05）。治疗后2周，A组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与治疗前相比差异均有统计学意义（P＜0.05）；B组在各个时间点泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与处理前相比均有不同程度下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。比较角膜共焦显微镜下去势干眼症雄兔的角膜上皮基底层形态情况，发现A组角膜炎症细胞和上皮基底细胞均减少。结论槲寄生滴眼液可有效减轻去势雄兔干眼症的症状和体征，具有一定的预防作用。

槲寄生滴眼液；去势雄兔；干眼症

干眼症是一种常见的多因素影响的疾病，可以由免疫功能紊乱，神经系统疾病如强风和较低的湿度等环境因素引起，特点是改变角膜上皮屏障和损伤眼部表面环境造成眼部干燥和炎症[1]。美国的调查结果显示在65～84岁的人群中干眼病占14.6%[2]；加拿大的13 517人问卷调查中28.7%的人群有眼干症状，1.6%为严重症状[3]。现如今，越来越多的干眼症是由于激素水平紊乱而导致。有研究表明体内睾酮水平与泪液分泌量之间呈正相关[4]。本研究复制去势雄兔干眼模型，观察雄兔去辜丸激素水平的下降后，应用槲寄生滴眼液的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组与手术方法

取健康成年雄兔36只，雄性，体质量1.5～2.0 kg，在无特殊病菌的恒温条件下喂养（由南昌大学医学院动物实验中心提供）。将24只雄兔随机分成两组，参照马轶群等[5]的方法将24只雄兔行双侧睾丸切除术，切除辜丸及附辜，结扎输精管及精索静脉，复制去势雄兔模型。A组12只（12眼）直接滴入槲寄生滴眼液，B组12只（12眼）直接滴入生理盐水，剩下的C组12只（12眼）雄兔仅切开阴囊，不切除睾丸，眼部不给与任何处理。36只雄兔均连续缝合阴囊皮肤，再局部涂碘配注意预防感染，全部选用雄兔的左眼进行实验。本研究实验符合动物伦理委员会（以下简称伦理委员会）要求，充分考虑到了动物的利益，减少动物了的应激、痛苦和伤害，尊重动物生命，采取痛苦最少的方法处置动物。

1.2 槲寄生滴眼液的制备

取槲寄生粉末约1 g，精密加入盐酸乙醇溶液30ml，加氯仿提取5次（20、20、20、15和15ml），用氯仿-甲醇（80∶1）30ml冲洗，弃去洗液，再用氯仿-甲醇（20∶1）50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解等，得到所需槲寄生提取液。以蒸馏水溶解槲寄生提取物，水∶提取物质量比为1∶0.1，加入眼润滑剂羧甲基纤维素，浓度控制1.5%，加入碳酸氢钠NaHCO3以及氯化钾KCl作为缓冲系统，浓度控制在0.1%以下。经过一系列的检测与调整最后加入保存剂苯扎溴铵，其浓度控制在0.005%。

1.3 观察方法

确保每次检查的温度、地点、时间、湿度及照明亮度相同，分别于治疗前与治疗后2、4和8周行泪液分泌实验（schirmer’s test，SIT）、常用SchimerⅠ实验和角膜荧光素染色（fluorescein staining，FL）检查。同时观察泪中含有多种抗微生物蛋白，本实验观察的蛋白包括泪液蛋白（tear protein，TP）、乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）、溶菌酶（Lysozyme，LZM）和淀粉酶（Amylase）。SIT是用一条滤纸并将一端折弯置眼内，其余部分悬垂于皮肤表面，检测记录5min后试纸泪液浸润的长度（不包括反折），参照文献的标准[6]，5min后测量滤纸上泪痕的长度，若长度＜5mm则提示干眼。角膜荧光素染色∶将荧光素滴于兔下眼结膜囊内，使其瞬目后，在裂隙灯下观察角膜上皮的染色情况，评分参考文献[7]：评分采用12分法，将角膜分为4个象限，依据不同的染色情况将每个象限分为0～3分，无染色为0分，＜5个点计为1分，≥5个点计为2分，≥5个点并有丝状物染色或溃疡计为3分。8周后从耳静脉对去势雄兔推注空气处死，立即取其泪角膜浸泡于4%甲醛液中，常规石蜡切片及HE和PAS染色，然后在角膜共焦显微镜下观察角膜上皮基底层形态。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prim 5.00统计软件进行数据处理，对各亚组症状评分以均数±标准差（±s）表示描述统计数据的集中位置和离散程度；计数资料用χ2检验，多时间点比较首先采用重复测量设计的方差分析，不同时间点组内两两比较时，采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后及两组间各项干眼检测指标评定结果比较

不同组间、不同时间点间SIT和FL相比，差异有统计学意义（FSIT=5.54和 11.76，FFL=11.26和6.52，P＜0.05）。A、B两组治疗前，SIT和FL相比差异无统计学意义（tSIT=0.542，tFL=0.714，P＞0.05）；治疗2、4和8周后，A组SIT和FL较治疗前稍有改变，差异均无统计学意义（tASIT=0.722、0.932和0.761，tAFL=0.653、0.752和0.952，均为P＞0.05），而B组SIT和FL较处理前恶化，差异均有统计学意义（tBSIT=5.913、6.411和 8.735，tBFL=3.883、6.329和7.712，均为P＜0.05）；A、B两组在术后2周时SIT和FL相比，差异均无统计学意义（tSIT=0.562，tFL=0.832，P＞0.05），但A、B两组在术后4和8周时SIT和FL相比，差异均有统计学意义（tSIT=3.542和4.127，tFL=5.329和7.156，P＜0.05）。见图1。

2.2 两组用药前后各时间点泪液蛋白比较

不同组间、不同时间点间泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。处理前A、B两组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比较，差异均无统计学意义（t=0.528、0.414、0.743和0.943，P＞0.05）；术后2周，A组泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与术前相比差异均有统计学意义（t=3.123、2.833、4.629和5.831，P＜0.05），术后4和8周，泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与术前相比差异均无统计学意义（t=0.831、0.554、0.635和0.531，t=0.572、0.329、0.571和0.397，P＞0.05），而B组在各个时间点泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性与处理前相比均有不同程度下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）；A、B两组术后8周泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性相比，差异均有统计学意义（t=6.618、5.182、5.776和7.629，P＜0.05）。见图2。

图1 两组处理前和处理后各时段SIT和FL比较

图2 两组患者手术前后泪液蛋白比较

2.3 处理前后及两组间共聚焦显微镜观察结果

正常角膜上皮基底层细胞显示为光暗细胞体，窄的细胞边界（图3A）。A组可见少数炎症细胞，上皮基底细胞数量趋于正常（图3B）。B组角膜上皮细胞体积增大，角膜上皮层可见有呈亮光样炎症细胞，上皮基底细胞密度明显增加（图3C）。炎症细胞进行计数发现，A组2个月后炎症细胞和上皮基底细胞密度分别为（81±16）个/mm2和（3 004±107）个/mm2，而B组炎症细胞和上皮基底细胞密度分别为（252±21）个/mm2和（4 234±212）个/mm2，两组比较，差异均有统计学意义（tBC=5.174，tIC=3.821，P＜0.05）。

图3 槲寄生滴眼液、生理盐水对去势干眼症雄兔的角膜上皮基底层形态的影响

3 讨论

干眼症可以有各种各样的症状包括眼睛干涩、有异物感、视力模糊、刺激和眼痛。目前，干眼多是以局部对症治疗为主，包括人工泪液、糖皮质激素及免疫抑制剂等眼液滴眼以及行泪道栓塞治疗。

槲寄生为桑寄生科，味苦、性平，归肝、肾经。具祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎的功效，为历版药典所收载。用色谱等方法从槲寄生中分离得到多个黄酮类化合物，主要有：3'-甲基鼠李素，3'-甲基鼠李素-3-葡萄糖甙，异鼠李素-3-葡萄糖甙，异鼠李素-7-葡萄糖甙（isorhamnetin-7-O-β-D-glucoside），3'-甲基圣草素，3'-甲基圣草素-7-葡萄糖甙（3'-methylerlodi ctyol-7-O-β-D-glucoside）又称槲寄甙甲，槲寄生新甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ等[8]。槲寄生提取物中主要含有的黄酮类物质属于植物雌激素的一种，可与性激素受体结合而发挥作用；有人利用放射性示踪标记的方法研究还表明黄酮类物质是细胞膜雄激素受体的刺激物，可以与细胞膜雄激素受体结合发挥生物学效应。

目前基础研究已证实泪腺、睑板腺、角膜和结膜上均分布有雄激素受体[9]。槲寄生提取物可能可以与其结合发挥拟雄激素作用。另一方面，由于雄激素、黄酮类化合物均为杂环多酚类化合物，可以利用其化学结构的相似性，维持体内雄激素的正常水平，治疗某些雄激素水平下降导致的疾病。研究已证明某些黄酮类化合物具有拟雄激素作用。

近年来已有研究表明密蒙花茶、鬼针草在动物实验上能用于治疗雌/雄激素下降导致的干眼模型，密蒙花茶、鬼针草提取物滴眼剂中主要成分为黄酮类物质，可显著抑制雄激素水平降低后干眼症的发生[10]。MCVEY等[11]对F1鼠进行连续大豆异黄酮灌胃，连续灌胃120 d后，检测F1鼠睾丸和精液中雄激素含量，与对照组比较均有显著的升高。DEENI等[12]研究发现，槲寄生有着广谱的抗菌活性，对某些多重耐药细菌和真均有效果。同时槲寄生中含有凝集素、磷脂成分可促进机体的免疫力，提高抑菌能力。槲寄生中的甲基鼠李素用于抗新生血管、抗炎和抗肿瘤，并研究其能通过抑制VEGFR2信号通道而发挥抑制新生血管、抗炎和抗肿瘤作用，而干眼本身就是一种眼部炎症，对干眼抗炎发挥一定的作用[13]。此外，槲寄生对于多种眼表微生物具有抑菌作用，同时含大量胆碱，可引起流泪，防止干眼患者的眼表状态进一步恶化。

本研究结果显示：槲寄生滴眼液可有效减轻去势雄兔干眼症的症状和体征，具有一定的预防作用。A组在使用槲寄生滴眼液2、4和8周后SIT和FL较治疗前稍有改变，可能因为槲寄生水煎液中的黄酮类化合物发挥拟雄激素的作用，与眼表组织雄激素受体结合，促进眼睑腺体分泌。而B组SIT和FL较治疗前明显恶化，进一步体现出A组使用槲寄生滴眼液治疗后的效果。A、B两组术后8周泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性都有所改变。A组术后2周效果明显，泪液总蛋白量、乳铁蛋白、溶菌酶及淀粉酶活性都在逐渐恢复正常，4和8周后已完全恢复正常。B组在术后的2、4和8周与术前相比均有不同程度下降，表明有恶化趋势。此外本次研究比较角膜共焦显微镜下去势干眼症雄兔的角膜上皮基底层形态情况，发现A组角膜炎症细胞和上皮基底细胞均减少，逐渐趋于正常组，槲寄生滴眼液有效地减少了炎症反应，改善了睑板腺、泪腺的分泌。经槲寄生滴眼液治疗干眼方便简单，不会对其他部位产生影响。

综上所述，对于去势雄兔干眼症，槲寄生滴眼液可较快而明显地改善干眼的症状和维持泪液蛋白成分。作为一种安全有效、给药途径简单、副反应少且廉价的治疗干眼的方法，具有广泛临床应用及推广价值。

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（张西倩 编辑）

Experimental study on m istletoe eye drops in prevention of xerophthalm ia of castrated male rabbits*

Lei Ye,Lin-hong Ye,Ying Zhang,RongWei,Nan Jiang,Chong-gang Pei,Gui-ping Gao,Yi Shao
(Departmentof Ophthalmology,the First Affiliated Hospital,Nanchang University, Nanchang,Jiangxi330006,China)

ObjectiveTo investigate the experimental effect ofmistletoe eye drops in prevention of xerophthalmia of castrated male rabbit.MethodThirty-six healthy male rabbits were chosen.The castrated dry eye models were established in 24male rabbits and random ly divided into 2 groups,i.e.group A(mistletoe eye drop group)and group B (normal saline group).In the remaining 12 rabbits (12 eyes,group C)the scrotum was cut and the testes were saved.Schirmer test(SIT),corneal fluorescein(FL),tear proteins,and corneal condition under confocalmicroscope were checked before treatment and 2,4 and 8 weeks after treatment.ResultsAfter treatment for 2,4 or 8 weeks, SIT and FL were slightly changed in the group A without statistical differences(P＞0.05),while SIT and FL were significantlyworsened than those before treatment in the group B(P＜0.05).In the group A,tear protein,lactoferrin, lysozyme and amylase activity 2 weeks after treatment had statistical differences from those before treatment(P＜0.05).In the group B tear total protein content,lactoferrin,lysozyme and amylase activity at all time points significantly decreased compared with those before treatment(P＜0.05).Observation of the base layer of corneal epithelium in the castrated male rabbits under corneal confocalmicroscope revealed that corneal inflammatory cells and epithelial basal cells were reduced in the group A.ConclusionsMistletoe eye drops can effectively reduce the signs and symptoms of dry eyes of the castratedmale rabbits and have a certain preventive effect.

mistletoe eye drops;castrated male rabbit;xerophthalmia

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.005

1005-8982（2017）07-0020-05

2016-11-21

国家自然科学基金（No：81160118、81460092、81400372）；江西省远航工程（No：2014022）；江西省青年科学基金（No：20151BAB215016）；江西省科技支撑计划项目（No：20151BBG70223）；江西省卫计委中医药科技计划项目（No：2015JX126）

邵毅，E-mail：freebee99@163.com；Tel：0791-88596614