薯蓣丸对乳腺癌化疗小鼠免疫功能的影响*

贺昀，谢甦，李丽红，赵大尉，张雲杰，关惠婷

（1.贵州医科大学 贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院 贵州 贵阳 550004）

薯蓣丸对乳腺癌化疗小鼠免疫功能的影响*

贺昀1，谢甦2，李丽红2，赵大尉1，张雲杰1，关惠婷1

（1.贵州医科大学 贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院 贵州 贵阳 550004）

目的 验证薯蓣丸改善乳腺癌小鼠化疗后免疫功能的作用并探讨其作用机制。方法将BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、化疗组和化疗+中药组，每组8只，注射4T1细胞悬液复制荷瘤模型，空白组除外。成瘤后予化疗组、化疗+中药组注射多西他赛，注射后第2天化疗+中药组予中药灌胃。21 d后处死小鼠，检测小鼠血清中白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素10（IL-10）、γ-干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。结果与模型组比较，化疗组及化疗+中药组IL-2、IFN-γ降低，TNF-α、IL-10升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与化疗组比较，化疗+中药组IL-2、INF-γ升高，IL-10降低，差异有统计学意义（P＜0.05），TNF-α有升高的趋势但差异无统计学意义（P＞0.05）。结论薯蓣丸可提高化疗后乳腺癌小鼠的免疫功能。

薯蓣丸；乳腺癌小鼠；IL-2；IL-10；IFN-γ；TNF-α

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据世界卫生组织统计，全球每年有120万妇女罹患乳腺癌[1]。乳腺癌的发生发展严重影响女性健康生活及生存质量。目前乳腺癌有以手术治疗为主结合放疗、化疗、内分泌治疗的一套较为成熟的治疗方案[2]。其中，化疗是一种重要的全身性治疗手段，被广泛应用于临床。但其具有细胞毒性作用，对正常细胞尤其是高度致敏的淋巴细胞也有杀伤作用，从而导致机体免疫功能下降[3]。大量临床研究表明中药在提高机体免疫功能方面有确切的疗效[4-6]。本实验通过复制BALB/c小鼠乳腺癌模型，采用化疗及化疗+中药2种干预手段，检测小鼠血清中白细胞介素2（Inter leukin-2，IL-2）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子 -α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素10（Interleukin-10，IL-10）的含量，探讨薯蓣丸对化疗后乳腺癌小鼠免疫功能的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康BALB/c小鼠，32只，雌性，6周龄，体重（20±2）g左右，由贵阳医学院实验动物中心提供，饲养于临床实验中心SPF级动物房。

1.1.2 实验细胞 4T1小鼠乳腺癌细胞株，购买于中科院上海细胞库。

1.1.3 实验药品 中药方剂：薯蓣丸，组成如下：薯蓣20 g、甘草18 g、生晒参5 g、当归10 g、阿胶6 g、桂枝6 g、干地黄10 g、神曲10 g、川芎6 g、麦门冬5 g、芍药5 g、白术5 g、杏仁5 g、柴胡6 g、桔梗5 g、茯苓5 g、干姜3 g、白蔹3 g、防风5 g、大豆卷6 g、大枣30 g，药材购买于贵州医科大学附属医院中药房。根据“人与动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”换算小鼠的用量，一次取5 d的药量进行煎熬，具体煎药步骤如下：向人工智能电煎药砂锅中加入300ml水，浸泡30min，将煎好的药液浓缩至12ml左右，相当于1.50 g生药/ml的浓度，置于4℃冰箱中储存备用。化疗药物：多西他赛（江苏奥赛康药业股份有限公司，批号：20150101）购买于贵州医科大学附属医院。

1.1.4 实验试剂 胎牛血清、RPMI1640培养基均购买于美国GIBCO公司，IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ试剂盒购买于北京超研生物有限公司，批号：201508。

1.2 方法

1.2.1 分组 将32只BABL/c小鼠随机分为空白组、模型组、化疗组和化疗+中药组，每组8只。

1.2.2 细胞培养 传代培养4T1乳腺癌细胞株，使用含10%胎牛血清的RPM1640培养基、置37℃、5%的二氧化碳CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，每天换液，待细胞长至90%～95%予以传代。

1.2.3 复制动物模型 取对数期的4T1乳腺癌细胞，用PBS缓冲液将细胞重悬，调整细胞浓度约为1×107个/ml，取细胞悬液0.1ml，皮下接种于小鼠左侧腹部[7]，予空白组小鼠相同部位注射等量生理盐水。7 d左右即可形成5mm×5mm左右的肿块。

1.2.4 给药、观察 成瘤后第7天下午，予化疗组、化疗+中药组腹腔注射多西他赛6.28mg/kg共1次（用生理盐水补满0.1ml）[8]，余两组腹腔注射0.1ml生理盐水。于注射后第2天，化疗+中药组每天上午予0.3ml中药灌胃，其余3组予0.3ml生理盐水灌胃，给药周期为21 d。

1.2.5 处死、取样 在全部实验过程中，化疗组及化疗+中药组各有1只老鼠因灌胃操作不当而死亡，此外在取血过程中，化疗+中药组的1只老鼠因挣扎剧烈，导致取血失败。脱臼（颈）处死小鼠（处死前天晚上予小鼠禁食）。取小鼠眼球静脉血，固定小鼠，将眼球上方的皮肤上提，充分暴露眼球，用眼球剪迅速剪掉眼球，血滴入标记好的离心管中，将每只小鼠的血分别装好静置20min后，离心（3 000 r/min 4℃10min），取血清，备用。

1.2.6 指标检测 ELISA检测各组IL-2、IL-10、IFN-γ、TNF-α的表达。取血清，备用。洗液洗酶孔板，设空白孔、待测样品孔，每孔加样本稀释液40μl，再加待测样品10μl，封板膜封板，37℃温育30min，洗板，每孔加酶标试剂50μl（空白孔除外），封板，37℃温育30 min，洗板，每孔先加A显色剂50μl，再加B显色剂50μl，震荡混匀，37℃避光显色15min，加终止液50μl。酶标仪450 nm波长测定吸光度（OD值）。依据标准曲线计算各样本IL-2、IL-10、IFN-γ、TNF-α的浓度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS.19.0统计软件处理数据，数据以均数±标准差（±s）表示，计量资料采用单因素方差分析进行比较，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织HE染色结果

病理切片显示：癌细胞多呈圆形或椭圆形，核大，核仁染色深，核浆比率大，分裂活跃，呈实性片状弥漫性分布，少数呈腺腔样（由红色箭头所示），浸入周围组织及横纹肌，部分伴坏死。提示：肿块为癌变组织，复制模型成功。见图1、2。

2.2 IL-2、TNF-α及IFN-γ含量的表达

如表1所示：与空白组比较，模型组IL-2（P=0.015）、IFN-γ（P=0.027）、TNF-α（P=0.000）含量降低，差异有统计学意义；与模型组比较，化疗组及化疗+中药组IL-2（P=0.000和0.002）、IFN-γ（P=0.000和0.032）含量降低，TNF-α（P=0.002和0.001）含量升高，差异有统计学意义；与化疗组比较，化疗+中药组IL-2（P=0.011）、IFN-γ（P=0.044）含量升高，差异有统计学意义。TNF-α（P=0.563）含量有升高的趋势但不明显，差异无统计学意义。以上结果说明小鼠在罹患乳腺癌后，免疫功能下降，予以化疗单独治疗后，小鼠免疫功能进一步下降，加用中药治疗能有效地提高小鼠免疫功能，而TNF-α含量的升高可能与多西他赛能作用于肿瘤坏死因子受体，促进TNF-α有关。

图1 小鼠肿瘤组织染色结果 （HE染色×100）

图2 小鼠肿瘤组织染色结果 （HE染色×200）

表1 各组小鼠血清IL-2、TNF-α、INF-γ含量的表达 （pg/ml，±s）

表1 各组小鼠血清IL-2、TNF-α、INF-γ含量的表达 （pg/ml，±s）

注：1）与空白组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05；3）与化疗组比较，P＜0.05

组别IL-2IFN-γTNF-α空白组（n=8） 31.48±1.12 1 570.08±179.11 581.53±110.27模型组（n=8） 29.56±1.591） 1 363.32±187.251） 353.58±93.471）化疗组（n=7） 24.76±1.531）2） 941.91±161.731）2） 531.77±107.982）化疗+中药组（n=6）F值P值26.94±1.441）2）3）31.022 0.000 1 148.62±169.071）2）3）17.660 0.000 564.75±88.752）8.366 0.001

2.3 IL-10含量的表达

如表2所示：与空白组比较，模型组IL-10（P=0.026）的含量升高，差异有统计学意义；与模型组比较，化疗组及化疗+中药组IL-10（P=0.000和0.013）含量升高，差异有统计学意义；与化疗组比较，化疗+中药组IL-10（P=0.039）的含量降低，差异有统计学意义，以上结果说明小鼠在罹患乳腺癌后，血清中IL-10的含量升高，免疫功能下降，化疗进一步加重此趋势，在服用中药治疗后能有效地降低小鼠血清IL-10的含量，从而改善小鼠的免疫功能。

表2 各组小鼠血清IL-10含量的表达 （pg/ml，±s）

表2 各组小鼠血清IL-10含量的表达 （pg/ml，±s）

注：1）与空白组比较，P＜0.05；2）与模型组比较，P＜0.05；3）与化疗组比较，P＜0.05

组别IL-10空白组（n=8） 643.39±65.87模型组（n=8） 732.13±89.301）化疗组（n=7） 911.51±72.461）2）化疗+中药组（n=6）F值P值840.36±67.701）2）3）20.747 0.000

3 讨论

乳腺癌是一种发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤[9]，越来越多的研究者认识到机体免疫功能与肿瘤的发生发展与有着密切的关系。机体抗肿瘤免疫主要是以细胞免疫为主，尤以T细胞最为重要[10]。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子促进细胞免疫而增加机体抗肿瘤的免疫效应。其中IL-2、IFN-γ都可激活单核/巨噬细胞、NK细胞杀瘤活性的分泌，从而加强了机体抗肿瘤免疫效应[11]；TNF-α可直接杀伤或抑制某些肿瘤细胞，使肿瘤细胞DNA断裂，细胞萎缩死亡，而达到抗肿瘤的效果；Th2细胞主要通过分泌IL-10等免疫抑制性细胞因子，并直接拮抗IL-2、IFN-γ、TNF-α等Th1型细胞因子对细胞免疫起抑制性作用[12-13]。有研究表明[13-14]，乳腺癌患者血清中Th2型细胞因子IL-10呈高表达，Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α呈低表达，而化疗会加重这一趋势。IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10含量的高低与肿瘤的发生发展有着密切的关系。故本实验选用这几个指标观察中药是否能改善乳腺癌小鼠化疗后免疫功能。

乳腺癌在中医学中属于“乳岩”“乳癖”范畴[15]，历代医家认为乳腺癌发生以正气不足，气血亏虚为本，风邪痰毒瘀阻于乳络而发病，属本虚标实之证。“癌毒”为有形之邪其发展进一步耗气伤血。而化疗作为“药毒”之邪，在祛邪的同时又会加重脏腑机能及气血阴阳的损伤。在机体本虚、癌毒、药毒这三重因素的叠加之下机体始终处于一个脏腑功能受损、气血阴阳失衡的状态。机体气血阴阳的失调及脏腑亏损又进一步导致有形之邪气滞、痰凝、血瘀、毒蕴的积聚。因而乳腺癌患者在化疗后呈现出正气不足、气血亏虚、虚实夹杂、易感外邪的复杂病因病机。这一病机主线始终贯穿在乳腺癌化疗患者的病程中。此时单纯补虚又恐留邪，单纯攻邪又恐虚不受补，薯蓣丸作为复方大法的典范，其理法方药切合了乳腺癌化疗后患者所呈现出来复杂的病因病机。薯蓣丸出自《金匮要略·血痹虚劳病脉证并治》是治虚劳的主方[16]，其以薯蓣为君，立足脾胃；其方含四君子、四物汤、理中汤及桂枝、柴胡、防风以祛三阳之外邪，桔梗、白蔹、杏仁调畅气机使气血生化有源、气机升降有条，营卫调和，外邪得散。在临床的应中，因为化疗后患者表现出来的证型复杂、选方用药太多而忽略了乳腺癌患者化疗后这一复杂的病机主线，从而造成临床选方用药的杂乱无章，疗效不一，影响中医药对乳腺癌相关治疗的临床研究，而将薯蓣丸作为针对乳腺癌患者化疗后复杂病机的一个主方进行加减，有利于凝练出针对乳腺癌化疗患者的有效方剂。

本实验研究表明薯蓣丸可通过提高血清IL-2、IFN-γ含量及降低IL-10含量有效地改善化疗后乳腺癌小鼠免疫功能，为临床治疗乳腺癌化疗免疫功能低下患者提供用药依据。

[1]熊安稳,王雅杰.WWOX基因与乳腺癌的研究进展[J].医学研究杂志,2013,42(2):192.

[2]中国抗癌协会乳腺癌专业委员会.中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2015版)[J].中国癌症杂志,2015,25(9):307-749.

[3]丘嫦,陈前军,戴燕,等.扶正益气法对乳腺癌辅助化疗患者Th1/Th2细胞漂移的影响研究[J].新中医,2014,46(8):141.

[4]蔡美,周蘅.《金匮》薯蓣丸对小鼠免疫功能的影响[J].湖南中医药导报,2010,3(6):31-34.

[5]梁晶晶,贾文魁.加减薯蓣丸联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌临床观察[J].山西中医,2012,28(3):3-4.

[6]纪太芳,刘德华.中医扶正培本治疗对乳腺癌新辅助化疗患者细胞免疫功能的影响[J].中外医学研究,2016,14(5):48.

[7]严丽,李莉,郝芳,等.BALB/C小鼠乳腺癌4T1细胞株移植模型的建立[J].中国免疫学志,2014,30(6):794.

[8]刑英,倪虹.多西紫杉醇化疗方案对荷4T1乳腺癌小鼠T细胞功能的影响[D].2010,5:20.

[9]高忠诚,张莲芳,刘夫芸.COX-2和TGF－β1表达与乳腺癌发生发展相关性的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20(14):1057.

[10]丘嫦,戴燕,陈前军.Th1/Th2细胞漂移与乳腺癌化疗疗效的关系及中医“扶正”法对其影响的研究思路[J].辽宁中医杂志,2012, 39(5):780.

[11]THAKUR A,SCHALK D,SARKAR S H,et al.A Th1 cytokine-enriched microenvironment enhance tumor killing by activated T cells armed with bispecific antibodies and inhibits the development of myeloid-derived suppressor cell[J].Cancer Immunother,2012,61(4):497-509.

[12]CHANDLER SW,RASSEKH C H,RODMAN S M,et al.Immunohistochemical localization of interleukin-10 in human oral and pharyngeal carci-nomas[J].Laryngoscope,2002,112(5): 808-815.

[13]狄松波,陈清勇.非小细胞肺癌患者化疗前后细胞免疫功能的变化[J].实用医学杂志,2009,25(14):2341-2343.

[14]李岩,梁婧,刘文波,等.化疗对胃癌Th1和Th2类细胞因子漂移的影响及临床意义[J].中华肿瘤杂志,2004,26(12):732-734.

[15]ZHANG Z Q,ZHU Z M,ZHANG B T,et.al.Frequent mutation of rsl13281616 and its ass-ociation with PVT1 expression and cell proliferation in breast cancer[J].Journal of Genetics and Genomics,2014,4(21):187-195.

[16]刘渡舟,苏宝刚,庞鹤.金匮要略诠解[M].北京:人民卫生出版社, 2013:108-109.

（张蕾 编辑）

Effect of Dioscorea pills on immunity ofm ice receiving chemotherapy for breast cancer*

Yun He1,Su Xie2,Li-hong Li2,Da-weiZhao1,Yun-jie Zhang1,Hui-tingGuan1
(1.Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China;2.The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China)

ObjectiveTo observe the effect of Dioscorea pills on the immunity ofmice with breast cancer after chemotherapy and itsmechanism of action.MethodsBALB/c mice were randomly divided into blank group,model group,chemotherapy group and chemotherapy plus TCM group with 8 mice in each group.Except the blank group, 24mice in other groupswere subcutaneously injected with 4T1 breast cancer cell suspension at the left abdomen to build a tumor-bearing mouse model.After tumor formation,the chemotherapy group and the chemotherapy plus TCM group were intraperitoneally injected with Docetaxel.Two days later,the chemotherapy plus TCM group was given Dioscorea pills by gavage,while the other three groups were given equal quantity of normal saline.Allmice were sacrificed 21 days after treatment.The serum levels of IL-2,IL-10,IFN-γand TNF-αwere measured.ResultsCompared with the model group,the levels of IL-2 and IFN-γof the chemotherapy group and the chemotherapy plus TCM group were significantly decreased,while the levels of TNF-αand IL-10 were significantly increased(P＜0.05).Compared with the chemotherapy group,the levels of IL-2 and INF-γof the chemotherapy plus TCM group were greatly increased,while the level of IL-10 was significantly decreased(P＜0.05);the level of TNF-αwas slightly increased without significant difference(P＞0.05).ConclusionsDioscorea pills can improve the immunity ofmicewith breast cancer after chemotherapy.

Dioscorea pill;mouse with breast cancer;IL-2;IL-10;IFN-γ;TNF-α

R-332；R 737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.002

1005-8982（2017）07-0005-04

2016-08-10

贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题基金（No：QZYY-2015-155）；贵州省科技厅联合基金（黔科合LH字[2014]7110）

谢甦，Tel：13985506996，E-mail：972254428@qq.com